[發(fā)明專利]一種利用鼻息肉組織培養(yǎng)人類上呼吸道類器官的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202210015326.6
• 申請日: 2022-01-07
• 公開（公告）號: CN114525237B
• 公開（公告）日: 2023-01-13
• 發(fā)明（設計）人: 李剛;汪珂;于言;韓日;王偉佳
• 申請（專利權）人: 南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 廣州容大知識產(chǎn)權代理事務所(普通合伙) 44326
• 代理人: 劉新年

本發(fā)明提供一種利用鼻息肉組織培養(yǎng)人類上呼吸道類器官的方法，是將獲取的鼻息肉組織處理得到細胞沉淀，再將細胞沉淀依次在擴增培養(yǎng)基和分化培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。本發(fā)明成功建立了一種鼻粘膜類器官誘導分化模型，形成一個標準規(guī)范化上皮類器官培養(yǎng)體系。該體系可以使通過鼻息肉獲得的鼻粘膜原代上皮細胞在體外持續(xù)擴增傳代、分化發(fā)育超過60天，成為同時具有長期增殖及多細胞群分化能力的上呼吸道類器官。

技術領域

本發(fā)明涉及類器官培養(yǎng)技術領域，具體涉及一種利用鼻息肉組織培養(yǎng)人類上呼吸道類器官的方法。

背景技術

既往已有眾多國內外學者討論了上呼吸道原代培養(yǎng)的方法，然而均無法做到長期體外培養(yǎng)以及維持原代細胞的分化能力。目前鼻粘膜體外模型主要分為2D原代細胞模型、2D腫瘤細胞系及器官外植體模型。2D原代單層上皮細胞間缺少細胞外基質，中斷細胞間連接從而限制了細胞的分化發(fā)育，致使其不具有體內器官組織的立體結構及多種細胞類型；2D腫瘤細胞系中許多信號通路都發(fā)生了改變，無法用作患者個體化的研究模型；而器官型外植體模型培養(yǎng)過程中遺傳變異和不可控的環(huán)境變量導致其可重復性不高，因此上述模型在鼻粘膜上皮生理功能及相關疾病的研究中仍具有較大的局限性。類器官是指體外3D培養(yǎng)胚胎干細胞、誘導性多能干細胞、成體干細胞，通過自我更新自我組織形成具有類似于來源器官組織形態(tài)結構、功能及遺傳學特征的培養(yǎng)物，在保持基因組和蛋白質組穩(wěn)定的情況下，能夠長期進行體外培養(yǎng)。類器官的核心在于干細胞群，其具有自我組織能力，通過調節(jié)細胞-細胞和細胞-細胞外基質的相互作用，完成細胞群體的自發(fā)排序，最大程度上模擬器官發(fā)生發(fā)展的基本過程，能夠再現(xiàn)來源器官的空間結構及某些特定功能(例如，排泄，過濾，神經(jīng)活動，收縮)。由于正常鼻粘膜組織不易獲取，可能會涉及醫(yī)學倫理問題，因而導致在鼻粘膜類器官上的研究比較滯后。鼻息肉是慢性炎癥導致鼻粘膜組織間隙的極度水腫，在中鼻道形成單發(fā)或多發(fā)息肉，基底細胞自我更新和定向分化干性潛能并未破壞，在去除炎性因子的干細胞培養(yǎng)體系內，wnt/β-catenin信號通路激活，可自組裝形成正常的鼻粘膜結構。本發(fā)明擬利用鼻息肉手術剩余組織實現(xiàn)體外長期培養(yǎng)鼻粘膜類器官，為鼻粘膜類器官的研究提供一種新的研究思路。

發(fā)明內容

針對目前鼻粘膜類器官研究技術的滯后和局限性，本發(fā)明提供一種利用鼻息肉組織培養(yǎng)人類上呼吸道類器官的方法。本發(fā)明的技術方案為：

一種利用鼻息肉組織培養(yǎng)人類上呼吸道類器官的方法，是將獲取的鼻息肉組織處理得到細胞沉淀，再將細胞沉淀依次在擴增培養(yǎng)基和分化培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。

進一步地，所述方法具體包括以下步驟：

步驟1，將獲得的鼻息肉組織表面粘液先去除，然后將組織置于含2％(v/v)雙抗的生理鹽水中反復振蕩洗滌幾次；

步驟2，將洗滌后的組織加入HBSS緩沖液，15min內將其處理成1～2mm³的組織碎塊；

步驟3，在組織碎塊中加入消化液I，于37℃恒溫消化1～3h，之后加入HBSS緩沖液終止消化，離心后保留沉淀；

步驟4，在步驟3獲得的沉淀中加入消化液II，于37℃恒溫消化8～12min后加入HBSS緩沖液終止消化，離心后保留沉淀；

步驟5，在步驟4獲得的沉淀中加入HBSS緩沖液重懸沉淀，用100μm濾網(wǎng)過濾并離心，得到鼻粘膜上皮細胞沉淀；

步驟6，在鼻粘膜上皮細胞沉淀中加入紅細胞裂解液裂解，之后加入HBSS緩沖液終止裂解，離心后獲得細胞沉淀；

步驟7，在細胞沉淀中加入預冷的Advanced DMEM/F12培養(yǎng)基混勻，再加入基質膠混勻，形成膠滴后接種于培養(yǎng)皿中靜置，凝固后于37℃恒溫倒置一段時間，之后加入擴增培養(yǎng)基于37℃、5％CO₂條件下擴增培養(yǎng)5～7天，每間隔2-3天更換一次擴增培養(yǎng)基；

步驟8，擴增培養(yǎng)后在體系中加入分化培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)13～18d，分化培養(yǎng)基隔天更換一次，即得。