[發明專利]一種利用鼻息肉組織培養人類上呼吸道類器官的方法

有效

• 申請號: 202210015326.6
• 申請日: 2022-01-07
• 公開（公告）號: CN114525237B
• 公開（公告）日: 2023-01-13
• 發明（設計）人: 李剛;汪珂;于言;韓日;王偉佳
• 申請（專利權）人: 南方醫科大學南方醫院
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 廣州容大知識產權代理事務所(普通合伙) 44326
• 代理人: 劉新年

1.一種利用鼻息肉組織培養人類上呼吸道類器官的方法，其特征在于：是將獲取的鼻息肉組織處理得到細胞沉淀，再將細胞沉淀依次在擴增培養基和分化培養基中進行培養；

所述方法具體包括以下步驟：

步驟1，將獲得的鼻息肉組織表面粘液先去除，然后將組織置于含2%（v/v）雙抗的生理鹽水中反復振蕩洗滌幾次；

步驟2，將洗滌后的組織加入HBSS緩沖液，15min內將其處理成1~2mm³的組織碎塊；

步驟3，在組織碎塊中加入消化液 I，于 37℃恒溫消化1~3 h，之后加入HBSS 緩沖液終止消化，離心后保留沉淀；

步驟4，在步驟3獲得的沉淀中加入消化液 II，于37℃恒溫消化 8~12min 后加入 HBSS緩沖液終止消化，離心后保留沉淀；

步驟5，在步驟4獲得的沉淀中加入HBSS 緩沖液重懸沉淀，用 100μm 濾網過濾并離心，得到鼻粘膜上皮細胞沉淀；

步驟6，在鼻粘膜上皮細胞沉淀中加入紅細胞裂解液裂解 ，之后加入HBSS 緩沖液終止裂解，離心后獲得細胞沉淀；

步驟7，在細胞沉淀中加入預冷的Advanced DMEM/F12 培養基混勻，再加入基質膠混勻，形成膠滴后接種于培養皿中靜置，凝固后于37℃恒溫倒置一段時間，之后加入擴增培養基于37℃、5%CO₂條件下擴增培養5~7天，每間隔 2-3 天更換一次擴增培養基；

步驟8，擴增培養后在體系中加入分化培養基繼續培養15d，分化培養基隔天更換一次，分化培養15天后使用分化培養基持續培養超過60天，即得；

所述步驟3中消化液I按照終濃度的組成為：100~120U/mL的hyaluronidase，200~250U/mL的collagenase III，10~15%的FBS；

所述步驟4中消化液II按照終濃度的組成為：0.1~0.2mg/mL的deoxyrubonuclease，10~15ng/mLEGF，10~15%的FBS；

所述擴增培養基按照終濃度組成為：不含Vit-A的B27，0.5-2×；N-acetylysteine，1-3mM；EGF，50-500ng/mL；Noggin，50-500ng/mL；R-spondin 1，50-1000ng/mL；A83-01，200-500nM；Nicotinamide，10-50mM；Glutmax，1-5×；Gastrin，10nM-50nM；青霉素-鏈霉素100×溶液，1-3×；SB202190，10-50μM；CHIR99021，1-4uM；FGF4，100-600ng/mL；以上成分均溶于Advanced DMEM/F12培養液中；

所述分化培養基按照終濃度組成為：不含Vit-A的B27，0.5-2×；N-acetylysteine，1-3mM；EGF，10~100ng/mL；Noggin，50-500ng/mL；R-spondin 1，50-1000ng/mL；A83-01，200-500nM；Nicotinamide，10-50mM；Glutmax，1-5×；Gastrin，10nM-50nM；青霉素-鏈霉素100×溶液，1-3×；SB202190，10-50μM； Insulin，2~5μg/mL；Hydro-cortisone，10~50nM；Transferrin，1~5μg/mL；Epinephrine，1~3μM；Bovine brain extract，0.1~0.5%；Retinoicacid，5~20nM；dexamethasone，50~80nM； 8-bromo-cAMP，0.1~0.2mM；以上成分均溶于DMEM/F12培養液中。

2.根據權利要求1所述的一種利用鼻息肉組織培養人類上呼吸道類器官的方法，其特征在于：所述擴增培養基按照終濃度組成為：不含Vit-A的B27，1×；N-acetylysteine，1mM；EGF，50ng/mL；Noggin，100ng/mL；R-spondin 1，250ng/mL；A83-01，500nM；Nicotinamide，10mM；Glutmax，1×；Gastrin，10nM；青霉素-鏈霉素100×溶液，1×；SB202190，10μM；以上成分均溶于Advanced DMEM/F12培養液中。

3. 根據權利要求1所述的一種利用鼻息肉組織培養人類上呼吸道類器官的方法，其特征在于：所述分化培養基按照終濃度組成為：不含Vit-A的B27，1×；N-acetylysteine，1mM；EGF，50ng/mL；Noggin，100ng/mL；R-spondin 1，250ng/mL；A83-01，500nM；Nicotinamide，10mM；Glutmax，1×；Gastrin，10nM；青霉素-鏈霉素100×溶液，1×；SB202190，10μM；Insulin，2.5μg/mL；Hydro-cortisone，25nM；Transferrin，2.5μg/mL；Epinephrine，1.5μM；Bovine brain extract，0.2%；Retinoic acid，15nM；以上成分均溶于DMEM/F12培養液中。