[發明專利]溫控無細胞反應體系的構建方法和該方法使用的質粒以及用途

在審

• 申請號: 202210013959.3
• 申請日: 2022-01-06
• 公開（公告）號: CN114672502A
• 公開（公告）日: 2022-06-28
• 發明（設計）人: 盧元;楊俊祝;汪琛
• 申請（專利權）人: 清華大學
• 主分類號: C12N15/63
• 分類號: C12N15/63;C12N15/87;C12P21/02;A61K9/127;A61K47/46;A61K47/42;A61K47/28;A61K47/24;A61K38/16
• 代理公司: 北京彩和律師事務所 11688
• 代理人: 閆桑田

本發明涉及一種質粒，其包括：編碼溫度敏感元件的基因；位于所述編碼溫度敏感元件的基因下游的能夠通過所述溫度敏感元件調控的操縱單元；位于所述操縱單元下游的表達目標蛋白的外源基因。本發明的質粒能夠通過所述溫度敏感元件調控的操縱單元調控目標蛋白的表達，當溫度升高到給定溫度時，所述溫度敏感元件失活從而操縱單元啟動表達目標蛋白，當溫度低于給定溫度時，所述溫度敏感元件抑制操縱單元啟動表達目標蛋白。本發明通過所述質粒進一步提供了一種溫控無細胞合成體系的構建方法，實現了在無細胞體系中通過溫度調控其中目標蛋白的表達。

技術領域

本發明屬于生物反應體系領域，具體涉及溫控無細胞反應體系的構建方法以及該方法使用的質粒以及用途。

背景技術

生物過程控制是生物制造和基因工程領域的一個重要問題。蛋白質合成和特定位點生物功能的時空激活和調控在生物技術、醫學和工業生產等領域具有重要意義。目前常用的控制方法是利用分子的化學效應調節基因表達。然而，該方法也存在一些缺點，包括化學效應不穩定\空間精度低以及化學誘導劑可能帶來的其他不良副反應。利用光和熱等物理信號來控制生物過程是一種理想的方法。相對于光信號對機體滲透性較差，溫度作為一種獨特的物理信號，可以準確有效地控制整體和局部溫度。溫度調節表達體系依賴于一種強大而精細調節的啟動子，避免使用特殊介質、有毒或昂貴的化學誘導劑。

目前，溫度調控表達已成功用于許多重組蛋白和肽的生產。溫度是一個非常明確的信號，可以通過外部觸發的方式如聚焦超聲、紅外光和磁粒子熱療)進行空間定向。理想的能對溫度變化做出響應的熱生物開關應該對急劇的溫度變化具有靈敏的開關效果。熱休克蛋白被迅速鑒定為真核細胞中已知的選擇性和誘導性轉錄調控的最引人注目的例子。脂質介導的構象在不同溫度下的變化導致膜相關蛋白的酶催化特性不同，這賦予膜相關蛋白具有溫度感知特性。被稱為“RNA溫度計”的溫度感應RNA分子，可以被設計成具有高靈敏度的靈活切換響應溫度。此外，轉錄抑制因子，在生物醫學相關的32-46℃范圍內，對細菌基因表達的閾值提供開關式控制。

然而，上述響應溫度變化的細胞內調節機制面臨著一些固有的困難。溫度是影響酶活性和復雜細胞代謝的重要因素，溫度變化可能導致細胞代謝強度和代謝流量的變化，從而對靶途徑產生不利影響。此外，體內不同合成途徑之間的相互作用可能限制了對蛋白表達的有效控制。因此，人們正在尋找一種更有效的方法來避免不必要的代謝途徑干擾溫度控制途徑。

無細胞蛋白合成(CFPS)體系是一個在體外合成活的有機體中應該已經產生且難以產生的蛋白質的平臺。CFPS以外源DNA或mRNA為模板，在體系中補充無機鹽、反應物質和能量底物。在細胞提取物提供的各種酶的作用下，蛋白質的合成可以在沒有細胞環境的情況下進行。與細胞體系相比，CFPS可以避免細胞內代謝通路在不同溫度下對目標代謝通路的干擾，提高溫度調節通路的特異性。此外，無細胞體系的特點是其簡單性和時間效率，作為一個開放的合成平臺，沒有膜的約束。它們只需要在生物合成反應中加入某些可以在幾小時內完成的物質，從而可以快速探索和篩選出CFPS中對控制元素有關鍵影響的因素。此外，先前的研究已經表明，由物理信號控制的無細胞合成體系被封裝在脂質體中，以模擬活細胞的種群通信，并且這種響應性人工細胞具有傳遞藥物的潛力。

發明內容

本發明在CFPS體系中建立了響應溫度的遺傳回路，從而在體外通過溫度控制蛋白質合成(圖1)。熱敏變體的噬菌體λ阻遏cI857(本發明中簡稱為cI)用于構建溫控無細胞蛋白質合成(以下稱為tcCFPS)體系，并完成重建質粒和優化細胞提取物與氧化還原條件。本發明還建立可以通過溫度控制蛋白質合成的人工細胞。

具體地，提供了以下技術方案：

1.一種質粒，其包括：

編碼溫度敏感元件的基因；

位于所述編碼溫度敏感元件的基因下游的能夠通過所述溫度敏感元件調控的操縱單元；

位于所述操縱單元下游的表達目標蛋白的外源基因。