[發明專利]溫控無細胞反應體系的構建方法和該方法使用的質粒以及用途

在審

• 申請號: 202210013959.3
• 申請日: 2022-01-06
• 公開（公告）號: CN114672502A
• 公開（公告）日: 2022-06-28
• 發明（設計）人: 盧元;楊俊祝;汪琛
• 申請（專利權）人: 清華大學
• 主分類號: C12N15/63
• 分類號: C12N15/63;C12N15/87;C12P21/02;A61K9/127;A61K47/46;A61K47/42;A61K47/28;A61K47/24;A61K38/16
• 代理公司: 北京彩和律師事務所 11688
• 代理人: 閆桑田

1.一種質粒，其包括：

編碼溫度敏感元件的基因；

位于所述編碼溫度敏感元件的基因下游的能夠通過所述溫度敏感元件調控的操縱單元；

位于所述操縱單元下游的表達目標蛋白的外源基因。

2.根據權利要求1所述的質粒，其中，能夠通過所述溫度敏感元件調控的操縱單元是指當溫度升高到給定溫度時，所述溫度敏感元件失活從而操縱單元啟動表達目標蛋白；以及當溫度低于給定溫度時，所述溫度敏感元件抑制操縱單元啟動表達目標蛋白，優選給定溫度為37-40℃。

3.根據權利要求1或2所述的質粒，其特征在于，所述溫度敏感元件和所述操縱單元配合使用，所述溫度敏感元件和所述操縱單元選自噬菌體λ阻遏cI-pR-pL啟動子、TlpA蛋白-TlpA啟動子、大腸桿菌阻遏蛋白TetR溫敏變體-tet操作子、大腸桿菌阻遏蛋白LacI(Ts)-lacO位點+LacI啟動子或大腸桿菌熱休克蛋白-pHSP啟動子中任意一種，優選，所述溫度敏感元件和所述操縱單元選自噬菌體λ阻遏cI-pR-pL啟動子。

4.根據權利要求1-3任一項所述的質粒，其特征在于，用于構建所述質粒的初始質粒選自pSB3K3質粒、pET系列質粒、pGEX系列質粒、pMAL系列質粒、pQE-1質粒、pQE-60質粒、pGS-21a質粒、pCDFDuet-1質粒、pRSFDuet-1質粒或pBluescriptII系列質粒中任意一種，優選為pSB3K3質粒。

5.根據權利要求1-4任一項所述的質粒，其特征在于，所述目標蛋白選自熒光蛋白、疫苗蛋白、抗體蛋白、生物催化酶、膜蛋白、多肽、細胞因子蛋白、激素蛋白或補體蛋白中的任意一種或兩種以上。

6.根據權利要求5所述的質粒，其特征在于，所述熒光蛋白為選自紅色熒光蛋白、綠色熒光蛋白、橙色熒光蛋白或黃色熒光蛋白中的任意一種或兩種以上。

7.根據權利要求1-6的任一項所述的質粒在無細胞反應體系中用于合成目標蛋白的用途。

8.一種脂質體藥物遞送體系，其包括：

如權利要求1-4任一項所述的質粒，其中的目標蛋白是藥物蛋白；

原核細胞或真核細胞的無細胞提取物；以及溫度敏感蛋白。

9.一種溫控無細胞反應體系的構建方法，該方法包括下述步驟：

-提供細胞提取物；

-使所述細胞提取物與下述質粒混合以形成溫控無細胞反應體系，該質粒包括編碼溫度敏感元件的基因和位于所述編碼溫度敏感元件的基因下游的能夠通過所述溫度敏感元件調控的操縱單元以及位于所述操縱單元下游的表達目標蛋白的外源基因；

-任選：向所述溫控無細胞反應體系中添加能量源物質和氨基酸混合液，無機鹽，轉錄翻譯輔助物質；

-任選：向所述溫控無細胞反應體系中添加氧化物質和還原物質；

-在給定溫度下在反應體系中表達所述目標蛋白。

10.一種溫控無細胞反應體系的構建方法，該方法包括下述步驟：

-提供包含溫度敏感元件的細胞提取物與不包含溫度敏感元件的細胞提取物的細胞提取物混合物；

-使所述細胞提取物混合物與下述質粒混合以形成溫控無細胞反應體系，該質粒包括能夠通過所述溫度敏感元件調控的操縱單元以及位于所述操縱單元下游的表達目標蛋白的外源基因；

-任選：向所述溫控無細胞反應體系中添加能量源物質和氨基酸混合液，無機鹽，轉錄翻譯輔助物質；

-任選：向所述溫控無細胞反應體系中添加氧化物質和還原物質；

-在給定溫度下在反應體系中表達所述目標蛋白。