[發明專利]一種馬來酸順反異構酶突變體

有效

• 申請號: 202210006581.4
• 申請日: 2022-01-05
• 公開（公告）號: CN114317510B
• 公開（公告）日: 2023-07-04
• 發明（設計）人: 周哲敏;劉中美;王暢;王相玉;周麗;崔文璟;郭軍玲
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N9/90
• 分類號: C12N9/90;C12N15/61;C12P13/20;C12N15/70;C12N1/21;C12R1/19
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 仇鈺瑩

本發明公開了一種馬來酸順反異構酶突變體，屬于酶工程技術領域。本發明的馬來酸順反異構酶的突變體的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.2所示，該突變酶的溫度穩定性相比野生酶有了較大的提高，同時該突變體具有更好的pH穩定性。將構建得到的馬來酸順反異構酶突變體與天冬氨酸酶AspA在大腸桿菌中偶聯表達，并以馬來酸為底物生產L?天冬氨酸，轉化率可達94％以上，具有廣闊的工業生產應用前景。

技術領域

本發明涉及一種馬來酸順反異構酶突變體，屬于酶工程技術領域。

背景技術

馬來酸順反異構酶(EC?5.2.1.1，Maleate?cis-trans?Isomerase，MaiA)是一種能夠將馬來酸(順丁烯二酸)催化轉化成富馬酸(反丁烯二酸)的異構酶，能夠在碳碳雙鍵不斷裂的情況下，實現順式丁烯二酸向反式丁烯二酸的異構化，屬于天冬氨酸、谷氨酸消旋酶超家族。由于具有催化反應pH范圍寬泛、較低的Km值以及較高平衡常數的特點，馬來酸順反異構酶被認為是可用于工業生產富馬酸的有潛力的生物催化劑之一。馬來酸順反異構酶廣泛存在于一些可吸收利用馬來酸的細菌中，如假單胞菌屬(Pseudomonas)、產堿桿菌屬(Alcaligenes)、沙雷氏菌屬(Serratia)、變形桿菌屬(Proteus)和節桿菌屬(Arthrobacter)等。但多數馬來酸代謝菌中此酶的活力較低、熱穩定性較差，制約了馬來酸順反異構酶在工業生產中的應用。

粘質沙雷氏菌(Serratia?marcescens)來源的馬來酸順反異構酶在室溫有較好的熱穩定性，酶活力也相對其他菌株來源的要高。2013年，王亞等人將從粘質沙雷氏菌(Serratia?marcescens)中擴增得到馬來酸順反異構酶編碼基因連接到pET24a載體上，并在Escherichia?coli?BL21(DE3)中實現了成功表達(王亞,崔文璟,周麗,等.粘質沙雷氏菌馬來酸順反異構酶表達純化及酶學性質[J].食品與生物技術學報,2014)。

發明內容

本發明的第一個目的是提供一種馬來酸順反異構酶突變體，以氨基酸序列如SEQID?NO.4所示的序列為親本序列，對親本序列第96位和100位中的一位或兩位進行取代。

在一種實施方式中，編碼所述親本的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.3所示。

在一種實施方式中，將第96位的谷氨酰胺取代谷氨酸，將第100的丙氨酸取代為甲硫氨酸。

在一種實施方式中，所述馬來酸順反異構酶突變體的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。

本發明的第二個目的是提供編碼所述馬來酸順反異構酶突變體的基因。

在一種實施方式中，所述基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。

本發明的第三個目的是提供含有所述基因的載體。

在一種實施方式中，所述載體包括但不限于pET系列、Duet系列、pGEX系列、pHY300、pHY300PLK、pPIC3K或pPIC9K系列載體。

優選地，以pET24a(+)為載體。

本發明的第四個目的是提供表達所述馬來酸順反異構酶突變體或含有所述基因的微生物細胞。

在一種實施方式中，以大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、畢赤酵母為宿主細胞。

優選地，以大腸桿菌BL21宿主細胞；更優選地，以敲除fumA和fumC基因的大腸桿菌BL21為宿主細胞。

本發明的第五個目的是提供一種生產所述馬來酸順反異構酶突變體的方法，將表達所述馬來酸順反異構酶突變體的微生物細胞接種于2×YT培養基中，35～37℃培養至OD₆₀₀為0.6～0.8時，加入誘導劑IPTG于37℃誘導14～16h。