[發明專利]一種青海湖裸鯉肌肉細胞系構建方法

在審

• 申請號: 202210001963.8
• 申請日: 2022-01-04
• 公開（公告）號: CN114317419A
• 公開（公告）日: 2022-04-12
• 發明（設計）人: 衛福磊;梁健;尹衛;許丁凡;岳苗;謝保勝;楊建新;俞錄賢;豐朝暉;祁宏芳;田文根;王洪超;周衛國
• 申請（專利權）人: 青海大學;青海湖裸鯉救護中心（青海省魚類原種良種場）
• 主分類號: C12N5/077
• 分類號: C12N5/077;A01N1/02;C12R1/91
• 代理公司: 成都華風專利事務所(普通合伙) 51223
• 代理人: 杜朗宇

本發明公開了一種青海湖裸鯉肌肉細胞系構建方法，包括原代培養、傳代培養、細胞凍存與復蘇，所述原代培養的細胞培養液的組分包括：基礎培養基、10～30％牛血清、200～400IU/mL青霉素、200～400μg/mL鏈霉素、1～5mmol/L谷氨酰胺和1～5mmol/L mmol/L丙酮酸鈉；所述傳代培養的細胞培養液的組分包括：基礎培養基、10～30％牛血清、50～250IU/mL青霉素、50～250μg/mL鏈霉素、1～5mmol/L谷氨酰胺和1～5mmol/L mmol/L丙酮酸鈉；所述細胞凍存的凍存液組分包括：基礎培養基、10～30％牛血清、50～250IU/mL青霉素、50～250μg/mL鏈霉素、5～30％DMSO、1～5mmol/L谷氨酰胺和1～5mmol/L mmol/L丙酮酸鈉。本發明的制備方法簡單，無需特殊設備，在一般的無菌培養室內均可操作，制備得到的細胞生長良好、穩定，可用于營養、免疫、環境毒性、基因功能分析等研究。

技術領域

本發明屬于細胞培養技術領域，具體涉及一種青海湖裸鯉肌肉細胞系構建方法。

背景技術

青海湖裸鯉(Gymnocyprisprzewalskii)，俗稱湟魚，屬鯉形目(CyPriniformes)，鯉科(Cyprinidae)，裂腹魚亞科，裸鯉屬，主要分布于中國青海湖及其湖周支流，為高原低溫鹽堿性水域經濟魚類，是青海湖中唯一的經濟魚類，也是我國重要的經濟魚類之一。其喜棲息于灘邊、大石堆間流水緩慢處、深潭或巖縫中，適應性強，在半咸水(青海湖水含鹽量12～13‰)或淡水中均可生活。在自然條件下，青海湖裸鯉的生長極為緩慢，生長到300～500g平均需要7～10年的時間。自20世紀60年代開始，青海湖周圍幾十萬畝草原被開墾為農田，流入青海湖的108條河流被人為攔河筑壩，阻塞繁殖通道，許多河流干涸斷流，致使裸鯉無法到淡水中產卵，造成大量裸鯉在河口地帶死亡。有關資料表明，青海湖現有裸鯉資源量約為7500噸，不足開發初期的1/10，而目前，鳥島棲息的鳥類每年要吞食近千噸的裸鯉，加上近年來由于裸鯉的生存環境受到污染、破壞和過度捕撈等原因，造成青海湖裸鯉資源量嚴重下降，漁業資源破壞嚴重，同時，伴隨著青海湖鹽度的逐年升高，青海湖裸鯉資源保護面臨著重要的挑戰。

為保護青海湖裸鯉資源，青海湖裸鯉人工增殖放流技術在過去的二十余年里已經逐漸成熟，該技術需要自然條件下成熟的青海湖裸鯉親本作為性細胞來源，用于人工授精和仔魚孵化養殖，該技術需要在特定時間段進行。養殖青海湖裸鯉的人工繁育技術還未建立，目前還未見有全人工繁育青海湖裸鯉群體的相關報道，因此，在對青海湖裸鯉進行自然適應、進化、疾病等研究時，通常需要大量的青海湖裸鯉個體，獲取青海湖裸鯉個體的來源只能依靠捕獲野生個體進行，這與保護該珍稀魚類種質資源形成了亟待解決的矛盾。

建立青海湖裸鯉魚類細胞系作為細胞模型，是解決以上問題的重要方法。魚類細胞培養起于20世紀60年代，發展至今已建立了280余株細胞系，中國的魚類細胞培養歷經30多年，只建立了50余株細胞系，建立細胞系的物種不足中國魚類總數的1.5％(中國魚類超過3500種)，由此可見，細胞系的構建速度是非常緩慢的，本身存在一定的困難。且相較于其他魚類細胞培養，由于自然條件下的青海湖裸鯉個體通常為患病個體，攜帶多種寄生蟲，在細胞培養中更易發生污染，細胞致死率較高，導致失敗率上升。因此，目前亟需建立一種細胞致死率低、能獲得大量的肌肉細胞，用于探究青海湖裸鯉生長的基礎研究的細胞系構建方法。

發明內容

本發明的目的在于提供一種青海湖裸鯉肌肉細胞系構建方法，能夠獲得大量的肌肉細胞，用于探究魚類生長的基礎研究。

為了實現上述目的，本發明采用如下技術方案：

本發明提供了一種青海湖裸鯉肌肉細胞系構建方法，包括原代培養、傳代培養、細胞凍存與復蘇，所述原代培養的細胞培養液的組分包括：基礎培養基、10～30％牛血清、200～400IU/mL青霉素、200～400μg/mL鏈霉素；

所述傳代培養的細胞培養液的組分包括：基礎培養基、10～30％牛血清、50～250IU/mL青霉素、50～250μg/mL鏈霉素；