[發(fā)明專利]具有低水平VA-RNA的生產(chǎn)者細(xì)胞

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202180086441.6
• 申請(qǐng)日: 2021-12-20
• 公開（公告）號(hào): CN116670292A
• 公開（公告）日: 2023-08-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 克斯汀·海因;伊內(nèi)絲·多卡莫-吉爾-岡加爾維斯;西爾克·維辛;本·哈德耶斯特
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 塞維克制藥有限責(zé)任公司
• 主分類號(hào): C12N15/86
• 分類號(hào): C12N15/86
• 代理公司: 北京華夏泰和知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11662
• 代理人: 陰亮

本發(fā)明涉及包含編碼腺相關(guān)病毒(AAV)衣殼蛋白的核酸的宿主細(xì)胞，其中圍繞AAV衣殼蛋白VP1的起始密碼子的蛋白激酶R(PKR)激活序列是失活的，同時(shí)保持AAV衣殼蛋白VP1、VP2和VP3的功能性表達(dá)。本發(fā)明還涉及生產(chǎn)腺相關(guān)病毒(AAV)的方法，其包括在本發(fā)明的宿主細(xì)胞中表達(dá)所述AAV的步驟。

本發(fā)明涉及包含編碼腺相關(guān)病毒(AAV)衣殼蛋白的核酸的宿主細(xì)胞，其中圍繞AAV衣殼蛋白VP1的起始密碼子的蛋白激酶R(PKR)激活序列是失活的，同時(shí)保持AAV衣殼蛋白VP1、VP2和VP3的功能性表達(dá)。本發(fā)明還涉及生產(chǎn)腺相關(guān)病毒(AAV)的方法，其包括在本發(fā)明的宿主細(xì)胞中表達(dá)所述AAV的步驟。

腺相關(guān)病毒(AAV)是感染人類和某些其他靈長(zhǎng)類物種的小型病毒。它們屬于依賴細(xì)小病毒屬(Dependoparvovirus)，依賴細(xì)小病毒屬又屬于細(xì)小病毒科(Parvoviridae)。它們是小型(20nm)復(fù)制缺陷型無包膜病毒。

目前已知AAV不會(huì)引起任何疾病，只會(huì)引起非常輕微的免疫應(yīng)答。幾個(gè)額外的特點(diǎn)使AAV成為創(chuàng)造用于基因治療的病毒載體，以及創(chuàng)造同基因人類疾病模型的有吸引力的候選者。盡管在天然病毒中，病毒攜帶基因確實(shí)整合到宿主基因組中，但是使用AAV的基因治療載體能夠感染正在分裂和靜止的細(xì)胞，并且以染色體外狀態(tài)繼續(xù)存在而不整合到宿主細(xì)胞的基因組中。

最近，基于AAV衍生的載體，批準(zhǔn)的產(chǎn)品以及基因治療臨床試驗(yàn)的數(shù)量已經(jīng)迅速增加。基因治療中AAV載體的優(yōu)點(diǎn)是優(yōu)秀的安全譜、上述非致病性、轉(zhuǎn)基因的穩(wěn)定表達(dá)以及轉(zhuǎn)導(dǎo)分裂和非分裂細(xì)胞的可能性。

重組AAV的生產(chǎn)目前需要大量組分。通常由AAV基因組編碼的復(fù)制酶(Rep)和衣殼(Cap)蛋白是生產(chǎn)重組病毒所需的，并以反式提供。輔助基因能夠源自不同輔助病毒，最常見的是取自腺病毒的輔助病毒基因E1A、E1B、E2A、E4orf6和VA?RNA(病毒相關(guān)的RNA)。此外，需要含有側(cè)接末端反向重復(fù)序列(ITRs)的目的基因(GOI)的轉(zhuǎn)移載體。

當(dāng)前基于AAV的生產(chǎn)系統(tǒng)主要依賴于以下技術(shù)，然而這些技術(shù)具有若干缺點(diǎn)。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染通常需要二或三質(zhì)粒系統(tǒng)(含有目的基因的轉(zhuǎn)移載體；具有腺病毒輔助功能的pHelper；提供衣殼和復(fù)制酶功能的pAAV-Rep2CapX(CapX＝不同AAV血清型的衣殼功能))。然而，該等技術(shù)缺乏足夠的規(guī)模性、穩(wěn)健性和再現(xiàn)性，并且需要質(zhì)粒DNA的高成本。具有已經(jīng)穩(wěn)定整合的目的基因的所謂生產(chǎn)者細(xì)胞系主要基于HEK或HeLa細(xì)胞。然而，該等細(xì)胞需要使用輔助病毒，例如腺病毒進(jìn)行額外感染。在AAV生產(chǎn)期間添加輔助病毒需要首先生產(chǎn)相應(yīng)的輔助病毒，然后廣泛純化所產(chǎn)生的AAV載體以便從最終產(chǎn)品中去除輔助病毒，以及不存在輔助病毒的昂貴證據(jù)。這同樣適用于基于單純性皰疹病毒(HSV)和桿狀病毒的系統(tǒng)，后者還缺乏足夠的規(guī)模性和穩(wěn)健性。

多種困難阻礙了產(chǎn)生完全穩(wěn)定的基于AAV的生產(chǎn)者細(xì)胞系，其中生產(chǎn)AAV所必需的所有組分穩(wěn)定地整合在細(xì)胞中。將所有輔助功能整合至細(xì)胞中具有挑戰(zhàn)性。在CAP或HEK293細(xì)胞中，E1A和E1B已經(jīng)組成型表達(dá)。輔助功能E2A和E4orf6對(duì)細(xì)胞有毒性。然而，這些輔助功能能夠由誘導(dǎo)型啟動(dòng)子表達(dá)。對(duì)于非編碼VA?RNA來說，這更困難，因?yàn)槠銹olIII啟動(dòng)子位于其自身的編碼序列中。因此，目前沒有用于已經(jīng)證實(shí)高水平表達(dá)VA?RNA的穩(wěn)定的細(xì)胞系。

VA?RNA是在腺病毒中發(fā)現(xiàn)的非編碼RNA。它對(duì)調(diào)節(jié)翻譯起作用。該RNA有兩個(gè)拷貝，稱為VAI或VA?RNAI和VAII或VA?RNAII。這兩個(gè)VA?RNA基因在腺病毒基因組中是不同的基因。VA?RNAI是主要的，較低水平表達(dá)VA?RNAII。VAI刺激包括E3和六鄰體在內(nèi)的早期和晚期腺病毒基因的翻譯。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染試驗(yàn)已表明VAI增加結(jié)合核糖體的轉(zhuǎn)錄物的穩(wěn)定性。此外，VAI在細(xì)胞中加工，以創(chuàng)造能夠充當(dāng)siRNA或miRNA的22個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的RNA。此外，VAI用作雙鏈RNA激活的蛋白激酶R的誘騙RNA，其會(huì)磷酸化真核起始因子2(eIF2)。