[發明專利]具有低水平VA-RNA的生產者細胞

在審

• 申請號: 202180086441.6
• 申請日: 2021-12-20
• 公開（公告）號: CN116670292A
• 公開（公告）日: 2023-08-29
• 發明（設計）人: 克斯汀·海因;伊內絲·多卡莫-吉爾-岡加爾維斯;西爾克·維辛;本·哈德耶斯特
• 申請（專利權）人: 塞維克制藥有限責任公司
• 主分類號: C12N15/86
• 分類號: C12N15/86
• 代理公司: 北京華夏泰和知識產權代理有限公司 11662
• 代理人: 陰亮

1.宿主細胞，其包含

編碼腺相關病毒(AAV)衣殼蛋白的核酸，

其中圍繞AAV衣殼蛋白VP1的起始密碼子的蛋白激酶R(PKR)激活序列是失活的，同時保持AAV衣殼蛋白VP1、VP2和VP3的功能性表達。

2.如權利要求1所述的宿主細胞，其中所述PKR激活序列通過替換編碼衣殼前mRNA的序列的內含子的剪接供體和剪接受體位點1而失活。

3.如權利要求1或權利要求2所述的宿主細胞，其中通過由不同的啟動子替換天然AAV衣殼蛋白啟動子p40，并由不同來源的內含子替換編碼衣殼序列之外的含有剪接供體和剪接受體位點1的一部分p40內含子，使所述PKR激活序列失活。

4.如權利要求1至3中任一權利要求所述的宿主細胞，其中天然AAV衣殼蛋白啟動子p40被誘導型啟動子替換，和/或天然AAV衣殼蛋白啟動子p40內含子在衣殼編碼序列之外被替換內含子替換，所述替換內含子替換剪接供體和剪接受體位點1并提供合適的剪接供體和剪接受體位點。

5.如權利要求4所述的宿主細胞，其中所述替換內含子選自SV40內含子、合成的CAG啟動子內含子和β珠蛋白內含子。

6.如權利要求1至5中任一權利要求所述的宿主細胞，其還包含在誘導型啟動子的控制下的編碼AAV復制酶(Rep)蛋白的核酸，和/或

編碼腺病毒E1A和E1B蛋白的核酸，和/或

在誘導型啟動子的控制下的編碼腺病毒E2A和E4orf6蛋白的核酸。

7.如權利要求1至6中任一權利要求所述的宿主細胞，其還包含編碼含有一個或多個目的基因(GOI)的轉移載體的核酸。

8.如權利要求1至7中任一權利要求所述的宿主細胞，其中控制AAV衣殼蛋白表達的誘導型啟動子和/或控制AAV復制酶蛋白表達的誘導型啟動子和/或控制腺病毒E2A和E4orf6蛋白表達的誘導型啟動子選自tet誘導型啟動子、cumate誘導型啟動子、他莫昔芬誘導型啟動子、雷帕霉素誘導型啟動子、FKCsA誘導型啟動子、ABA誘導型啟動子、核糖開關控制型啟動子和熱休克啟動子驅動的光開關系統。

9.如權利要求1至8中任一權利要求所述的宿主細胞，其中通過由不同的啟動子替換天然AAV衣殼蛋白啟動子p40，并由不同來源的內含子替換編碼衣殼序列之外的含有剪接供體和剪接受體位點1的一部分p40內含子，使所述PKR激活序列失活，

其中所述天然AAV衣殼蛋白啟動子p40被組成型或誘導型啟動子替換，并且所述天然AAV衣殼蛋白啟動子p40內含子被部分替換，即由替換剪接供體和剪接受體位點1的內含子在衣殼編碼序列之外替換，以及

其中從所述AAV衣殼蛋白的編碼序列的所述啟動子至所述起始密碼子的相應核苷酸序列具有結構：

啟動子-N1-內含子-N2-ATG

其中

啟動子是組成型或誘導型啟動子，

N1是1至4000個核苷酸的序列，

內含子選自提供具有最小共有序列GT/AG的合適的剪接供體和剪接受體位點的內含子，

N2是1至4000個核苷酸的序列，以及

ATG是AAV衣殼蛋白編碼序列的起始密碼子。

10.如權利要求9所述的宿主細胞，其中啟動子是誘導型啟動子，選自如第三代TRE3G啟動子的tet誘導型啟動子、cumate誘導型啟動子、他莫昔芬誘導型啟動子、雷帕霉素誘導型啟動子、FKCsA誘導型啟動子、ABA誘導型啟動子、核糖開關控制型啟動子和熱休克啟動子驅動的光開關系統。

11.如權利要求9或權利要求10所述的宿主細胞，其中所述內含子選自SV40內含子、合成的CAG啟動子內含子和β珠蛋白內含子。