[發明專利]負載核酸的紅細胞細胞外囊泡

在審

• 申請號: 202180008703.7
• 申請日: 2021-01-12
• 公開（公告）號: CN115151277A
• 公開（公告）日: 2022-10-04
• 發明（設計）人: T·戈查;H·羅迪什;W·M·烏斯曼;R·楊
• 申請（專利權）人: 胭脂紅治療私人有限公司
• 主分類號: A61K47/00
• 分類號: A61K47/00
• 代理公司: 上海一平知識產權代理有限公司 31266
• 代理人: 徐迅;崔佳佳

公開了一種負載有核酸貨物的紅細胞細胞外囊泡(RBCEV)；用于制備所述經負載的囊泡的方法；以及其囊泡的治療性用途。所述核酸貨物可以是DNA或RNA，單鏈的或雙鏈的，以及線性的或環狀的。

本申請要求2020年1月13日提交的US 62/960,569和2020年2月26日提交的US 62/981,880的優先權，所述專利的內容和要素出于所有目的以引用的方式并入本文。

技術領域

本發明涉及細胞外囊泡，并且特別地但非排他性地涉及源自紅細胞的細胞外囊泡。

背景技術

細胞外囊泡(EV)是介導細胞間生物分子的轉移的細胞來源的脂質膜結合囊泡。普遍認為，存在兩類EV，即1)外泌體，所述外泌體由內體膜向內出芽而產生、從而在多泡體中形成最終將與質膜融合并將外泌體釋放到細胞外空間中的腔內囊泡；和2)微泡，所述微泡由質膜直接出芽而形成。通常，外泌體的直徑是30-100nm，而微泡大于100nm。

由于其天然的跨細胞膜轉運較大的大分子的能力，EV已被提出作為藥物遞送媒介物用于轉運小分子、蛋白質和核酸，包括短RNA如反義寡核苷酸(ASO)、短干擾RNA(siRNA)和微小RNA(miRNA)，長RNA如信使RNA(mRNA)，或甚至是雙鏈DNA(dsDNA)。EV介導的核酸遞送受到高度追捧，因為這些大分子是有前景的藥物候選物，具有治療多種疾病的潛力，但核酸作為藥物的開發由于多種原因而受到阻礙，所述原因包括它們無法穿透細胞膜、免疫原性和對體循環中的核酸酶的易感性。其它幾種類型的遞送媒介物如脂質納米顆粒和陽離子聚合物已用于核酸遞送，但由于肝毒性和有限肝外生物分布，它們的應用受到限制。

在EV中負載核酸將克服大部分這些挑戰，因為EV具有生物相容性，具有獨特的嗜性，并且根據它們的細胞來源，它們幾乎沒有毒性或免疫原性威脅。EV可通過在細胞源中轉染或過表達有效載荷、然后純化由這些細胞產生的EV而被內源性地負載，或者通過使用機械手段(即電穿孔、超聲處理、凍融、細胞擠出)或化學手段(即脂轉染或氯化鈣處理)直接負載分離的EV而被外源性地負載。根據文獻，負載核酸的大多數嘗試涉及短RNA，如siRNA、miRNA和ASO，并且這些有效載荷是通過外源性手段(通常是電穿孔)負載的。

將大于1000個堿基對的核酸負載到細胞外囊泡中的嘗試遇到了挑戰并且效率非常低(Mol Pharm.2015年10月5日；12(10):3650–3657)。有效載荷的大小是純化EV的外源負載的通常限制因素(PNAS3月24日,2015 112(12)E1433-E1442)(Mol Pharm.2015年10月5日；12(10):3650–3657)。此外，在不引起囊泡聚集、產量或功能損失的情況下成功地將大核酸負載到EV中是不可能的(Mol Pharm.2015年10月5日；12(10):3650–3657)。因此，通常大小超過1000個堿基對的DNA基因表達載體被認為是EV的具有挑戰性的貨物。

Yang等人(Nature Biomedical Engineering,可在安全http站點doi.org/10.1038/s41551-019-0485-1獲得)解釋，將外源核酸，特別是大信使RNA插入細胞分泌的外泌體中導致低產量。為了解決這個問題，他們開發了一種細胞納米穿孔方法，其中將源細胞用質粒DNA轉染，隨后用局部和瞬時電刺激進行刺激以促進攜帶轉錄mRNA和靶向肽的外泌體的釋放。與批量電穿孔和其它外泌體產生策略相比，他們報告了多達50倍的外泌體和超過103倍的外泌體mRNA轉錄物增加，即使來自基礎外泌體分泌水平較低的細胞也是如此。

WO2010/119256描述了用環狀和線性化pEGFP-NAD對外泌體進行電穿孔。電穿孔似乎保護環狀DNA質粒免受DNA酶I降解，但不能保護線性DNA。他們取得了不一致的結果，并且通常針對降解的保護水平較低。