[發(fā)明專利]一種能夠催化萊鮑迪苷A生成多種甜菊糖苷衍生物的糖基轉(zhuǎn)移酶CaUGT

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202111680606.0
• 申請(qǐng)日: 2021-12-30
• 公開（公告）號(hào): CN115558651A
• 公開（公告）日: 2023-01-03
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 宋浩;汪振洋;馬媛媛;魏曉珍;洪解放
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中化健康產(chǎn)業(yè)發(fā)展有限公司;天津大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N9/10
• 分類號(hào): C12N9/10;C12N15/54;C12N15/70;C12N15/75;C12N15/81;C12N1/21;C12N1/19;C12P19/56;C12P19/18;C12R1/19;C12R1/125;C12R1/84;C12R1/865
• 代理公司: 天津市北洋有限責(zé)任專利代理事務(wù)所 12201
• 代理人: 琪琛

本發(fā)明公開了一種能夠催化萊鮑迪苷A生成多種甜菊糖苷衍生物的糖基轉(zhuǎn)移酶CaUGT，構(gòu)建該酶在大腸桿菌重組中的重組菌，獲得的重組酶粗酶液及純化酶能將低值的催化萊鮑迪苷A生成高值的多種甜菊糖苷衍生物。其核酸序列為：a)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；或與a)的核苷酸序列不同，能夠編碼SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的核苷酸序列。將該酶基因克隆到大腸桿菌表達(dá)載體上，實(shí)現(xiàn)了該酶在大腸桿菌中的異源表達(dá)，獲得的重組蛋白CaUGT實(shí)現(xiàn)了以UDPG為糖基供體，催化底物萊鮑迪苷A直接生成萊鮑迪苷D、萊鮑迪苷I和萊鮑迪苷M2，能一步將低值的甜菊糖苷轉(zhuǎn)化為高值的甜菊糖苷，對(duì)生化法綠色轉(zhuǎn)化高值甜菊糖苷的產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟(jì)具有重大意義。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物工程及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種糖基轉(zhuǎn)移酶CaUGT在糖苷類化合物生產(chǎn)中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

甜菊糖苷是來(lái)自南美洲甜葉菊的一種天然甜味劑，因其高甜度(約為蔗糖的250-400倍)，零熱量的特性，在南美洲地區(qū)廣泛使用。近年來(lái)，在天然甜葉菊體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了多種甜菊糖苷等衍生物(包括甜菊糖苷、萊鮑迪苷A、萊鮑迪苷D、萊鮑迪苷M等)。此后，在生物催化反應(yīng)中，發(fā)現(xiàn)萊鮑迪苷D和萊鮑迪苷M存在同分異構(gòu)體萊鮑迪苷I和萊鮑迪苷M2。其結(jié)構(gòu)式如下：

萊鮑迪苷A、萊鮑迪苷D、萊鮑迪苷M分別于2008年、2013年、2014年獲得美國(guó)食品藥物管理局(USFDA)的一般安全(GRAS)認(rèn)證。

甜菊糖苷分別以β-1，β-(1-2)，β-(1-3)，β-(1-6)糖苷鍵連接不同數(shù)量的葡萄糖基，從而形成多種甜菊糖苷衍生物，但甜菊糖苷衍生物的最終均可以代謝為甜菊醇。因此，單一甜菊糖苷的安全性數(shù)據(jù)可用于支持其他甜菊糖苷衍生物的使用安全性。

在天然甜葉菊體內(nèi)萊鮑迪苷A在UGT91D2的催化下生成萊鮑迪苷D，同時(shí)也可在UGT76G1的催化下生成萊鮑迪苷I，萊鮑迪苷D和萊鮑迪苷I可進(jìn)一步糖基化生成萊鮑迪苷M和萊鮑迪苷M2。隨著糖基數(shù)量的增多，甜度逐漸提高，后苦味逐漸降低，但天然含量也逐漸降低，導(dǎo)致從天然種植物中直接提取高值的甜菊糖苷的經(jīng)濟(jì)效益較低。萊鮑迪苷I、萊鮑迪苷M2為萊鮑迪苷D和萊鮑迪苷M的同分異構(gòu)體，其差異僅在于糖基位置的不同，具有潛在的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。此發(fā)明可以廉價(jià)的萊鮑迪苷A為底物，一步法直接催化生成多種甜菊糖苷衍生物(包括包括萊鮑迪苷D、萊鮑迪苷I和萊鮑迪苷M2)，尤其在萊鮑迪苷M2的合成中，無(wú)需外源加入直接底物萊鮑迪苷D或萊鮑迪苷I，對(duì)甜菊糖苷的經(jīng)濟(jì)化生產(chǎn)具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容

為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問(wèn)題，本發(fā)明提供一種能夠催化萊鮑迪苷A生成多種甜菊糖苷衍生物的糖基轉(zhuǎn)移酶CaUGT以及重組菌在催化萊鮑迪苷A生成多種甜菊糖苷衍生物(包括萊鮑迪苷D、萊鮑迪苷I和萊鮑迪苷M2)方面的應(yīng)用，解決現(xiàn)有技術(shù)中從天然種植物中直接提取高值的甜菊糖苷的經(jīng)濟(jì)效益較低的問(wèn)題。

本發(fā)明的具體方案為：

一種催化萊鮑迪苷A生成多種甜菊糖苷衍生物的辣椒糖基轉(zhuǎn)移酶CaUGT，所述辣椒來(lái)源糖基轉(zhuǎn)移酶CaUGT核酸序列為：

a)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；

b)或與a)的核苷酸序列不同，能夠編碼SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的核苷酸序列。

一種重組載體，是將權(quán)利要求1所述辣椒來(lái)源糖基轉(zhuǎn)移酶CaUGT基因克隆到包括pPICZα-A/B/C、pPIC9K、pPIC9、pPinkα-HC、pYES2、YCplac33、YEplac195、pHT01、pHT08、pHT43、pET系列載體、pMAL、pCOLD系列載體和pBAD系列載體中的任意一種，構(gòu)建得到重組載體。

一種重組菌，將所述的重組載體轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞中，得到的重組菌；所述宿主細(xì)胞包括埃希氏菌屬、巴斯德畢赤酵母菌、釀酒酵母、枯草芽孢桿菌中的任意一種。