[發(fā)明專利]基于CRISPR/Cas9構(gòu)建Ets2基因超級(jí)增強(qiáng)子敲除動(dòng)物模型的方法及其應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202111674779.1
• 申請(qǐng)日: 2021-12-31
• 公開（公告）號(hào): CN114958908A
• 公開（公告）日: 2022-08-30
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 秦利濤;張倩;郭正隆;郝冰濤;王紅丹;張曉梅;王鑫;康冰;張安
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 河南省人民醫(yī)院
• 主分類號(hào): C12N15/85
• 分類號(hào): C12N15/85;C12N15/89;C12N15/113;C12N15/12;C12N15/55;A01K67/027
• 代理公司: 北京科家知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11427
• 代理人: 宮建華

本發(fā)明屬于生物工程和基因編輯技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于CRISPR/Cas9構(gòu)建Ets2基因超級(jí)增強(qiáng)子敲除動(dòng)物模型的方法及其應(yīng)用。SEts2敲除動(dòng)物模型的構(gòu)建方法包括如下步驟：1)靶向小鼠SEts2序列g(shù)RNA設(shè)計(jì)：2)將步驟1)中的一對(duì)gRNA與cas9質(zhì)粒共同注射小鼠胚胎，獲得F0代小鼠；3)鑒定SEts2基因型，篩選出陽性F0代小鼠；4)陽性F0代小鼠與野生型小鼠雜交得到F1代小鼠，F(xiàn)1代雜合小鼠自交獲得純合后代，從而構(gòu)建得到SEts2基因敲除的動(dòng)物模型。本發(fā)明基于CRISPR/Cas9技術(shù)實(shí)現(xiàn)對(duì)SEts2的定點(diǎn)敲除，具有操作簡(jiǎn)單、敲除效率高的優(yōu)勢(shì)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物工程、基因編輯和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于CRISPR/Cas9構(gòu)建Ets2基因超級(jí)增強(qiáng)子敲除動(dòng)物模型的方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

Ets2基因?qū)儆谵D(zhuǎn)綠因子(Transcription Factors,TFs)ETS家族成員，因?yàn)榘梢耘cDNA結(jié)合并且調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的ETS結(jié)構(gòu)域而被命名。ETS家族是目前所知最大的信號(hào)依賴的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，該家族包含30多個(gè)成員，其通過調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖與分化、細(xì)胞凋亡與衰老等作用，參與眾多生理和病理過程。Ets2基因編碼E26轉(zhuǎn)錄因子2(E26 oncogene homolog2)，可以調(diào)控眾多的下游靶基因，從而調(diào)節(jié)效應(yīng)細(xì)胞的增值、分化及凋亡。近期研究表明轉(zhuǎn)錄因子Ets2可以幫助建立和維持染色體的空間構(gòu)象，影響基因轉(zhuǎn)錄，從而調(diào)控細(xì)胞的行為及功能。然而，Ets2基因受到哪些順勢(shì)調(diào)控元件的調(diào)控仍不清楚。

超級(jí)增強(qiáng)子(Super Enhancer，SE)是最近發(fā)現(xiàn)的一類基因組調(diào)控序列，可以調(diào)節(jié)細(xì)胞類型特異性基因表達(dá)，與細(xì)胞發(fā)育和分化密切相關(guān)，影響腫瘤、糖尿病、自身免疫疾病等人類常見疾病。超級(jí)增強(qiáng)子通常距離受調(diào)控基因線性距離比較遠(yuǎn)，研究發(fā)現(xiàn)它們?cè)诳臻g上與啟動(dòng)子靠近，從而調(diào)控靶基因的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)ETS2基因附近存在超級(jí)增強(qiáng)子SuperEnhancer-Ets2(SEts2)，該增強(qiáng)子是否參與ETS2的調(diào)控，如何參與ETS2調(diào)控，這些仍不清楚。因此，通過CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)構(gòu)建SEst2序列敲除小鼠，對(duì)研究ETS2基因表達(dá)至關(guān)重要。

基因組編輯技術(shù)(Genome editing technology)是通過人工手段在基因組水平時(shí)對(duì)DNA序列進(jìn)行改造的遺傳操作技術(shù)，包括特定DNA片段的插入、敲除、替換和點(diǎn)突變。其主要原理是在基因組的特定位置產(chǎn)生雙鏈DNA斷裂(Double-suranded break,DSB)后通過非同源末端連接(Non-homologous end joining,NHE)或同源重組(Homologousrecombination,HR)的方式進(jìn)行修復(fù)。

隨著核酸研究的深入，基因編輯技術(shù)先后經(jīng)歷了鋅指核酸酶(zinc-fingernuclease，ZNF)、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶(Transcription Activator-likeEffector Nucleases,TALEN)及成簇規(guī)律短回文重復(fù)序列相關(guān)蛋白(Clustered RegularlyInterspaced Shot Palindromic repeats associated proteins,CRISPR/Cas)。由于CRISPR/Cas技術(shù)與其之前的基因編輯技術(shù)相比具有更高的靈活性、省時(shí)、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)勢(shì)，成為基因編輯技術(shù)的主流。本發(fā)明就是基于CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)C57/BL小鼠的Ets2基因超級(jí)增強(qiáng)子(SEts2)進(jìn)行編輯，從而得到SEts2純合敲除小鼠，為研究超級(jí)增強(qiáng)子SEts2對(duì)Ets2基因的調(diào)控功能提供合適的動(dòng)物模型。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明旨在提供一種基于CRISPR/Cas9構(gòu)建Ets2基因超級(jí)增強(qiáng)子敲除動(dòng)物模型的方法及其應(yīng)用。

針對(duì)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

第一方面，本發(fā)明提供基于CRISPR/Cas9構(gòu)建Ets2基因超級(jí)增強(qiáng)子敲除動(dòng)物模型的方法，包括如下步驟：

1)靶向C57小鼠SEts2序列的gRNA設(shè)計(jì)：