[發(fā)明專利]基于CRISPR/Cas9技術構建Bcl6基因超級增強子敲除動物模型的方法及應用

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• 申請日: 2021-12-31
• 公開（公告）號: CN114958907A
• 公開（公告）日: 2022-08-30
• 發(fā)明（設計）人: 郝冰濤;廖世秀;秦利濤;陳妍紅;白潔;任嚴新;時偉麗;趙慧茹;楊文柯
• 申請（專利權）人: 河南省人民醫(yī)院
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/89;C12N15/113;C12N15/55;C12N15/12;A01K67/027
• 代理公司: 北京科家知識產(chǎn)權代理事務所(普通合伙) 11427
• 代理人: 宮建華

本發(fā)明公開了基于CRISPR/Cas9技術構建Bcl6基因超級增強子敲除動物模型的方法及其應用。Bcl6?SE敲除的動物模型的構建方法包括如下步驟：1)靶向小鼠Bcl6?SE序列的gRNA設計：2)將步驟1)中的一對gRNA進行純化并和cas9質(zhì)粒共同注射小鼠胚胎，獲得F0代小鼠；3)鑒定Bcl6?SE基因型，篩選出陽性F0代小鼠；4)陽性F0代小鼠與野生型小鼠雜交得到F1代小鼠，F(xiàn)1代雜合小鼠自交獲得純合后代，從而構建得到Bcl6?SE基因敲除的動物模型。本發(fā)明基于CRISPR/Cas9技術實現(xiàn)對Bcl6?SE調(diào)控序列的定點敲除，具有操作簡單，敲除效率高的優(yōu)勢。

技術領域

本發(fā)明屬于生物工程的實驗動物模型技術領域，具體涉及一種基于CRISPR/Cas9技術構建Bcl6基因超級增強子敲除動物模型的方法及應用。

背景技術

Bcl6(B cell lymphoma 6)基因編碼一個含有保守鋅指結構的轉錄抑制因子，屬于BTB/POZ轉錄因子家族。Bcl6通過募集特異性染色質(zhì)修飾輔抑制復合體來抑制許多靶基因表達。Bcl6最初作為原癌基因被鑒定，在體液免疫和淋巴瘤發(fā)生中發(fā)揮關鍵作用。Bcl6可以介導彌散性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)細胞異常增殖、基因組不穩(wěn)定和分化阻滯。生發(fā)中心(Germinal Center)是B細胞產(chǎn)生高親和力抗體的地方，而Bcl6是生發(fā)中心的關鍵調(diào)節(jié)因子。Bcl6在B細胞早期發(fā)育中也發(fā)揮作用，可以對抗免疫球蛋白輕鏈V(D)J重組中誘發(fā)的凋亡。

超級增強子(super enhancers，SEs)是一種由連續(xù)排列的調(diào)控元件串聯(lián)形成的超長增強子，可以強力驅動細胞相關基因的表達，細胞中的數(shù)百個SEs控制著關鍵基因，決定細胞命運走向。在腫瘤發(fā)生、老年癡呆、糖尿病及許多自身免疫疾病中，均發(fā)現(xiàn)致病基因的表達與部分超級增強子的異常活化高度相關。研究表明Bcl6附近存在超級增強子(Bcl6-super enhancer，Bcl6-SE)，并且該增強子對Bcl6具有一定的調(diào)劑作用，從而參與T細胞的發(fā)育調(diào)控。然而，Bcl6-SE究竟是如何調(diào)控Bcl6基因的表達，從而影響T細胞發(fā)育的過程仍不是很清楚，因此構建超級增強子Bcl6-SE敲出小鼠顯得尤為重要。

規(guī)律成簇間隔短回文重復序列(clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats，CRISPR)及其相關Cas9蛋白介導的新一代基因編輯技術具有操作容易、成本低廉的優(yōu)勢，可實現(xiàn)精確高效的基因編輯功能，包括定點插入、定點敲除及定點突變等，已廣泛用于多種動植物的基因編輯。介于CRISPR/Cas9進行基因編輯的優(yōu)勢，本專利采用該技術對Bcl6-SE進行基因編輯，構建超級增強子敲出小鼠模型。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明旨在提供一種基于CRISPR/Cas9技術構建Bcl6基因超級增強子敲除動物模型的方法及其應用。

針對上述目的，本發(fā)明采用的技術方案如下：

第一方面，基于CRISPR/Cas9技術構建Bcl6基因超級增強子敲除動物模型的方法，包括如下步驟：

1)靶向C57小鼠Bcl6-SE序列的gRNA設計：

根據(jù)Bcl6-SE序列設計一對相應的gRNA，其中，gRNA的序列如SEQ ID NO.1和SEQID NO.2所示；

2)mRNA制備并顯微注射獲得F0小鼠：

將步驟1)中的一對gRNA進行純化并和cas9質(zhì)粒共同注射小鼠胚胎，獲得F0代小鼠；

3)鑒定Bcl6-SE基因型，篩選出陽性F0代小鼠；

4)陽性F0代小鼠與野生型小鼠雜交得到F1代小鼠，F(xiàn)1代雜合小鼠自交獲得純合后代，從而構建得到Bcl6-SE敲除的動物模型。