[發(fā)明專利]一種基于乙烯基锍鹽的生物大分子修飾方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202111661772.6
• 申請日: 2021-12-31
• 公開（公告）號: CN114349822B
• 公開（公告）日: 2023-10-20
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李子剛;尹豐;徐紅坤;孔凌微
• 申請（專利權(quán)）人: 深圳灣實驗室坪山生物醫(yī)藥研發(fā)轉(zhuǎn)化中心;北京大學(xué)深圳研究生院;深圳灣實驗室
• 主分類號: C07K7/06
• 分類號: C07K7/06;C07K1/113;C07K1/02;C07K1/04
• 代理公司: 上海驍象知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31315
• 代理人: 林煒

本發(fā)明提出一種基于乙烯基锍鹽的生物大分子修飾方法，具體為：用固相合成法將多肽接在樹脂上，生成乙烯基锍鹽多肽樹脂后，從樹脂上剪切下來；與生物大分子反應(yīng)，反應(yīng)溫度為25℃?37℃，pH值為7?9，反應(yīng)溶劑為水、乙腈、甲醇、乙醇、異丙醇、叔丁醇、乙二醇、甘油、二甲基亞砜、N,N?二甲基甲酰胺、或PBS溶液中的任意一種或兩種，反應(yīng)2?6小時；其中，多肽含有甲硫氨酸基團，生物大分子帶有巰基。本發(fā)明產(chǎn)率高，使用的反應(yīng)底物容易獲得，并且毒性較小，可以在弱堿性環(huán)境中反應(yīng)，適合實驗室和工業(yè)化多肽、蛋白質(zhì)和核酸藥物的化學(xué)修飾和改造。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于化學(xué)生物學(xué)領(lǐng)域，涉及一種基于乙烯基锍鹽的生物大分子修飾方法，具體涉及一種通過乙烯基锍鹽化合物，在水相和37℃條件下，修飾生物大分子的化學(xué)方法。

背景技術(shù)

生物大分子的化學(xué)修飾在化學(xué)生物學(xué)、分子生物學(xué)和藥物研發(fā)等研究領(lǐng)域中有重要作用。其中，多肽、蛋白質(zhì)和核酸與有機小分子藥物和探針的偶聯(lián)反應(yīng)是蛋白質(zhì)組學(xué)、藥物化學(xué)和生物技術(shù)研究的強大實驗工具。例如，抗體-藥物偶聯(lián)物的成功開發(fā)有賴于可靠的生物正交反應(yīng)的研究。傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)化學(xué)修飾方法主要集中于針對半胱氨酸和賴氨酸殘基的化學(xué)反應(yīng)。近年來，新型的蛋白質(zhì)修飾化學(xué)聚焦于傳統(tǒng)條件無法實現(xiàn)的氨基酸殘基的修飾，或極高效的修飾化學(xué)反應(yīng)。例如，可見光誘導(dǎo)的溫和條件下的蛋白質(zhì)修飾化學(xué)反應(yīng)。這種光氧化還原催化的歷程通過產(chǎn)生自由基來構(gòu)建獨特的化學(xué)鍵，提供了非傳統(tǒng)的生物大分子功能化的策略。

大部分生物大分子都包含巰基，現(xiàn)在技術(shù)中對生物大分子中巰基的修飾主要是使用碘乙酰胺(IAA)，具體以水作溶劑，將帶熒光標簽的IAA配置成溶液后與蛋白孵育后，通過檢測蛋白上熒光強度，以熒光強度作為IAA標記蛋白的標志。該技術(shù)的缺點在于IAA毒性較大，并且不能修飾甲硫氨酸。因此，探索新的生物大分子修飾方法具有很高的科學(xué)與社會價值。

發(fā)明內(nèi)容

針對生物大分子的化學(xué)選擇性修飾技術(shù)和應(yīng)用的需求，本發(fā)明提出一種基于乙烯基锍鹽的生物大分子修飾方法，反應(yīng)如下：

具體包括如下步驟：

(1)將多肽衍生為乙烯基锍鹽多肽：用固相合成法將多肽接在樹脂上，生成乙烯基锍鹽多肽樹脂后，將乙烯基锍鹽多肽從樹脂上剪切下來；

(2)將步驟(1)所得的乙烯基锍鹽多肽與生物大分子反應(yīng)，反應(yīng)溫度為25℃-37℃，pH值范圍為7-9，反應(yīng)溶劑為水、乙腈、甲醇、乙醇、異丙醇、叔丁醇、乙二醇、甘油、二甲基亞砜、N,N-二甲基甲酰胺或PBS溶液中的一種或幾種，反應(yīng)時間為2-6小時；

其中，所述多肽含有甲硫氨酸基團，所述生物大分子為帶有巰基的多肽、蛋白質(zhì)或核酸中的一種或幾種。

本發(fā)明中，所述步驟(2)中，反應(yīng)溫度為37℃，pH值為7.4，反應(yīng)溶劑為PBS溶液，反應(yīng)時間為4小時。

本發(fā)明中，所述步驟(1)中生成乙烯基锍鹽多肽樹脂的具體步驟為：在甲酸存在下，用二氯甲烷與乙腈的混合體系做溶劑，將接有多肽的樹脂浸在溶劑中，加入三氟甲磺酸2-溴-乙酯，反應(yīng)6小時，洗干凈樹脂，用N,N-二甲基甲酰胺與二氯甲烷的混合體系作溶劑，樹脂浸在溶劑中反應(yīng)即得乙烯基锍鹽多肽樹脂。

本發(fā)明中，所述步驟(1)中的乙烯基锍鹽多肽為PDM1、PDM2或PDM3中的一種或幾種。PDM1氨基酸序列為:QSPANIMYKV(SEQ ID NO.1所示)、PDM2氨基酸序列為:QSPANMYYKV(SEQ ID NO.2所示)、PDM3氨基酸序列為:QSPAMIYYKV(SEQ ID NO.3所示)。

本發(fā)明中，所述步驟(2)中乙烯基锍鹽多肽為PDM2，生物大分子為蛋白，其中，PDM2與蛋白的摩爾比為5。

本發(fā)明的有益效果在于：