[發明專利]MC38-N4/OT-I共培養系統篩選方法及其篩選的多糖組方與多糖組合物的應用

在審

• 申請號: 202111661714.3
• 申請日: 2021-12-30
• 公開（公告）號: CN114350604A
• 公開（公告）日: 2022-04-15
• 發明（設計）人: 任嬌艷;徐天雄;姚茂金;黃楚君
• 申請（專利權）人: 華南理工大學
• 主分類號: C12N5/078
• 分類號: C12N5/078;C12N5/09;C12Q1/02;A61K31/715;A61P35/00;A61P37/04
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司 44102
• 代理人: 林奕聰

本發明公開了MC38?N4/OT?I共培養系統篩選方法及其篩選的多糖組方與多糖組合物的應用。基于該篩選方法得到多糖組合物的步驟包括：獲得含特異性抗原和熒光蛋白的腫瘤靶細胞、分離免疫效應細胞、共培養腫瘤靶細胞與免疫效應細胞、評價多糖組方的免疫調節功能。本發明提供的共培養篩選方法，其優點在于：基于腫瘤微環境的特點模擬了腫瘤細胞和與免疫細胞的相互作用過程，兼具應用范圍廣、實驗結果可視化、高通量篩選等特點。本發明提供的多糖組合物，其原料包括姬松茸、灰樹花和陳皮，該組方具有改善機體免疫功能、增強抗腫瘤功效等，可用于免疫增強相關產品的開發，為食源性多糖組方應用于臨床免疫增強藥物提供實驗基礎和科學依據。

技術領域

本發明屬于功能食品技術領域，具體涉及MC38-N4/OT-I共培養系統篩選方法及其篩選的多糖組方與多糖組合物的應用。

背景技術

腫瘤的發生、生長及轉移與腫瘤細胞所處的內外環境密切相關。腫瘤微環境(Tumor micro-envirnment，TME)是指腫瘤細胞存在的周圍微環境，包括周圍的血管、免疫細胞、成纖維細胞、骨髓源性細胞、各種信號分子和細胞外基質。近年來，免疫療法由于能有效刺激宿主免疫系統，促進腫瘤微環境中免疫細胞殺死癌細胞，因此在癌癥治療中已經發展成為繼手術、化療、放療之后的第四種抗腫瘤治療手段。研究發現，天然多糖具有較強的預防腫瘤發生和抑制腫瘤的作用，且與傳統的腫瘤治療方法相比，天然多糖具有低毒和調節免疫的優點。食源性天然多糖不僅對大多數機體細胞都沒有明顯毒性，并且能刺激各種免疫活性細胞的增殖、分化和成熟，使機體的免疫系統得到恢復和增強，從而被公認為是一種重要的生物效應調節劑。因此尋找可以長期食用且副作用較小的食源性活性多糖對于腫瘤患者來說具有重大意義。

目前篩選免疫調節活性物質的動物模型主要包括：異種移植模型、同源移植模型、基因敲除模型、基因工程小鼠模型和人源基因敲入模型等。相比于動物模型，體外細胞模型具有實驗周期短、篩選通量高等優點。體外篩選免疫調節活性物質的模型主要有RAW264.7細胞極化模型、2D共培養模型、類器官和微流控細胞模型等。理想的多糖篩選體外試驗應較為接近地模擬體內的腫瘤微環境，以高靈敏度和特異性進行免疫治療的高通量篩選，以便對預期有效藥物進行進一步試驗。RAW264.7細胞極化方法無法真實模擬腫瘤微環境中細胞之間復雜的相互作用過程；類器官模型雖廣泛用于癌癥活檢組織培養，但通常也只包含腫瘤細胞而不包含免疫細胞。與單細胞體外篩選模型相比，共培養細胞模型是更復雜、更具生物相關性和預測性的細胞篩選法，共培養模型因能更好地模擬體內環境和對藥物治療的反應，所以更適用于化合物的篩選。基于腫瘤微環境的多細胞的性質，腫瘤細胞和免疫細胞共培養模型能模擬腫瘤微環境中細胞間的相互作用，可用于體外測試免疫療法以及免疫制劑的功效。

目前也需要開發更有效的體外細胞毒性檢測方法，通過量化腫瘤微環境中的免疫細胞對腫瘤細胞的殺傷作用，評估篩選物在腫瘤微環境中的免疫調節功效。其中，⁵¹Cr釋放試驗是最常見的體外檢測方法，通常被用于測量T細胞介導的細胞毒性作用，但該實驗具有放射性毒性，應用受到限制。Pimentel等研究提出利用螢火蟲熒光素酶試驗評估腫瘤細胞的靶向殺傷死亡率，該方法實驗過程繁瑣，不僅需要加反應底物，而且由于反應時間短需要快速檢測，實驗結果不能可視化，因此難以滿足實驗大規模篩選的需求(Olivo PimentelV,Yaromina A,Marcus D,Dubois LJ,Lambin P.A novel co-culture assay to assessanti-tumor CD8+T cell cytotoxicity via luminescence and multicolor flowcytometry.J Immunol Methods.2020Dec；487:112899.doi:10.1016/j.jim.2020.112899.Epub 2020Oct 15.PMID:33068606.)。對腫瘤細胞轉染熒光蛋白，在保證沒有放射性毒性的同時，用顯微成像和高內涵、高通量分析工具自動成像腫瘤靶細胞，從而實現共培養中腫瘤細胞的可視化，并可視化檢測共培養中免疫細胞的殺傷作用。