[發明專利]MC38-N4/OT-I共培養系統篩選方法及其篩選的多糖組方與多糖組合物的應用

在審

• 申請號: 202111661714.3
• 申請日: 2021-12-30
• 公開（公告）號: CN114350604A
• 公開（公告）日: 2022-04-15
• 發明（設計）人: 任嬌艷;徐天雄;姚茂金;黃楚君
• 申請（專利權）人: 華南理工大學
• 主分類號: C12N5/078
• 分類號: C12N5/078;C12N5/09;C12Q1/02;A61K31/715;A61P35/00;A61P37/04
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司 44102
• 代理人: 林奕聰

1.MC38-N4/OT-I共培養系統篩選方法，其特征在于，所述MC38-N4/OT-I共培養系統篩選方法包括如下步驟：

(1)用含特異性抗原及熒光蛋白的重組質粒轉染腫瘤靶細胞，轉染后加入抗生素篩選，持續藥篩后，熒光顯微鏡下觀察熒光蛋白的表達情況；經過單克隆擴培、流式細胞分選，得到表達特異性抗原的可視化腫瘤靶細胞；

(2)分離小鼠免疫臟器組織，研磨以及裂解紅細胞后，獲得免疫效應細胞的單細胞懸液；

(3)腫瘤靶細胞鋪板貼壁后，加入免疫效應細胞，同時加入待篩選物，進行共培養。

2.根據權利要求1所述MC38-N4/OT-I共培養系統篩選方法，其特征在于，步驟(1)中，所述含特異性抗原及熒光蛋白的重組質粒為pLVX-IRES-tdTomato-N4重組質粒；所述腫瘤靶細胞包括：LLC小鼠肺癌細胞、MC38小鼠結腸癌細胞、B16小鼠黑色素瘤細胞或GL261小鼠膠質母細胞瘤細胞中的一種以上；所述抗生素包括嘌呤霉素、青霉素或鏈霉素中的一種以上；所述抗生素的濃度為1-10μg/mL；所述藥篩的時間為4-15天。

3.根據權利要求1所述MC38-N4/OT-I共培養系統篩選方法，其特征在于，步驟(2)中，所述小鼠包括OT-I或OT-II小鼠；所述臟器包括脾臟、胸腺或淋巴結中的一種以上；所述免疫效應細胞為OT-I全脾臟免疫效應細胞。

4.根據權利要求1-3任一項所述MC38-N4/OT-I共培養系統篩選方法，其特征在于，步驟(3)所述免疫效應細胞與腫瘤靶細胞的細胞個數比例為(100-1)：1，步驟(3)所述共培養的時間為12-96h。

5.權利要求4所述MC38-N4/OT-I共培養系統篩選方法篩選的多糖組方，其特征在于，所述多糖組方組成原料包括有：姬松茸、灰樹花、陳皮、桑黃、靈芝、茯苓、當歸和枸杞中的一種以上，所述多糖組方為姬松茸多糖、灰樹花多糖、陳皮多糖、桑黃多糖、靈芝多糖、茯苓多糖、當歸多糖和枸杞多糖中的一種以上，所述多糖組方的免疫調節功能篩選評價包括：(1)腫瘤細胞與免疫細胞共培養后，胰酶消化，混合細胞收集于流式管中，離心后重懸細胞，檢測腫瘤靶細胞的數量，根據腫瘤靶細胞的死亡率篩選得到多糖組合物；(2)使用Cytation7高通量活細胞成像系統對共培養細胞進行高通量熒光成像篩選，根據腫瘤細胞熒光數量的變化篩選得到多糖組合物。

6.根據權利要求5所述MC38-N4/OT-I共培養系統篩選方法篩選的多糖組方，其特征在于，所述多糖組方中的姬松茸多糖、灰樹花多糖、陳皮多糖和桑黃多糖的質量份數比為(1-125)份：(1-125)份：(1-25)份：(0-25)份。

7.根據權利要求5所述MC38-N4/OT-I共培養系統篩選方法篩選的多糖組方，其特征在于，所述使用Cytation7高通量活細胞成像系統對共培養細胞進行高通量熒光成像篩選，用于篩選和評價具有免疫調節活性的物質；所述檢測通過熒光成像可視化。

8.權利要求5所述多糖組合物的應用，其特征在于，所述多糖組合物在制備增強CD8⁺T細胞抗腫瘤免疫記憶作用、增強機體免疫活性以及促進抗腫瘤功效的藥物中的應用。

9.根據權利要求8所述多糖組合物的應用，其特征在于，所述增強機體免疫活性主要在于提高CD8⁺T細胞的存活率以及CD8⁺CD62L的比例。

10.根據權利要求8所述多糖組合物的應用，其特征在于，所述促進抗腫瘤功效主要在于提高免疫細胞對含特異性抗原的腫瘤細胞的殺傷效果。