[發(fā)明專利]腸道類器官定向分化潘氏細(xì)胞的方法在審
| 申請?zhí)枺?/td> | 202111654672.0 | 申請日: | 2021-12-30 |
| 公開(公告)號: | CN114480274A | 公開(公告)日: | 2022-05-13 |
| 發(fā)明(設(shè)計)人: | 康樂;方雪;吳佳藝;宋銥航;賀子軒 | 申請(專利權(quán))人: | 中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院 |
| 主分類號: | C12N5/078 | 分類號: | C12N5/078;C12N5/071 |
| 代理公司: | 上海和華啟核知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31339 | 代理人: | 王仙子 |
| 地址: | 200433 *** | 國省代碼: | 上海;31 |
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| 摘要: | |||
| 搜索關(guān)鍵詞: | 腸道 器官 定向 分化 細(xì)胞 方法 | ||
本發(fā)明提供一種腸道類器官定向分化潘氏細(xì)胞的方法,包括如下步驟:獲取腸道類器官;將所述腸道類器官置入類器官培養(yǎng)基中;于所述類器官培養(yǎng)中加入DAPT和CHIR99021,對所述類器官培養(yǎng)基中的所述腸道類器官刺激預(yù)設(shè)時間。本發(fā)明的腸道類器官定向分化潘氏細(xì)胞的方法,通過在所述類培養(yǎng)基中加入DAPT和CHIR99021,可以在短時間內(nèi)獲取大量的、高純度的潘氏細(xì)胞。
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及動物類器官培養(yǎng)領(lǐng)域,特別是涉及一種腸道類器官定向分化潘氏細(xì)胞的方法。
背景技術(shù)
潘氏細(xì)胞是位于小腸及近端結(jié)腸隱窩基底部獨(dú)特的上皮細(xì)胞,雖然數(shù)量較少,但通過其分泌防御素、溶菌酶等為機(jī)體抵抗病原微生物,調(diào)節(jié)宿主免疫功能起到重要作用。此外,亦有研究證實(shí)潘氏細(xì)胞還有其他重要的功能,例如,潘氏細(xì)胞為Lgr5陽性干細(xì)胞提供必須的生境信號、潘氏細(xì)胞與腸道腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)等。關(guān)于潘氏細(xì)胞的功能還有許多尚未探索的領(lǐng)域,所以,亟待找尋一種方法可以在體外獲得大量潘氏細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)的研究。
類器官技術(shù),成為近年來生物、醫(yī)學(xué)界最熱門的前沿技術(shù)之一。腸道類器官是一種三維的腸道細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng),能夠在實(shí)驗室中利用人或動物的腸道干細(xì)胞增殖、分化為器官特異性細(xì)胞集合,并且以與體內(nèi)相近的方式,經(jīng)細(xì)胞分序及空間限制性系統(tǒng)進(jìn)行分化,從而完成自我更新、自我組建。現(xiàn)主要應(yīng)用于疾病模型的建立、藥物的篩選及檢測以及再生醫(yī)學(xué)方面的研究。然而,類器官培養(yǎng)技術(shù)也存在其局限性,由于體外培養(yǎng)的腸道類器官分化不可控性,使得類器官中混雜有分化為各種類型的腸道細(xì)胞,這成為了定向獲取大量的潘氏細(xì)胞的技術(shù)難題。
發(fā)明內(nèi)容
為實(shí)現(xiàn)上述目的及其他相關(guān)目的,本發(fā)明提供一種腸道類器官定向分化潘氏細(xì)胞的方法,包括如下步驟:獲取腸道類器官;將所述腸道類器官置入類器官培養(yǎng)基中;于所述類器官培養(yǎng)中加入DAPT和CHIR99021,對所述類器官培養(yǎng)基中的所述腸道類器官刺激預(yù)設(shè)時間。
可選地,所述預(yù)設(shè)時間為5~10天。
可選地,所述獲取腸道類器包括如下步驟:
取小腸,用冷PBS沖洗腸管若干次,去除腸內(nèi)容物;
將所述腸管縱行切開,在剪成預(yù)定長度的腸段;
將所述腸段移入裝有PBS的試管中;
晃動所述試管清洗,析出第一上清液,并去除第一上清液;
重復(fù)上一步驟若干次,直到所述第一上清液清亮;
棄掉最后得到的所述第一上清液;
向所述試管中加入隱窩分離液輕搖,以析出第二上清液;
去除所述第二上清液;
向所述試管中加入PBS,晃動試管,以析出第三上清液,觀察是否有腸道單元,并收集所述第三上清液;
重復(fù)上述步驟,直至收集到預(yù)設(shè)容積的所述第三上清液;
將所述第三上清液進(jìn)行離心處理,以得到腸道細(xì)胞;
使用洗滌液重懸所述腸道細(xì)胞,并對重懸后的所述腸道細(xì)胞進(jìn)行離心處理,以得到所述腸道類器官;
重復(fù)上一步驟。
可選地,用所述冷PBS沖洗所述腸管的次數(shù)為3~4次;所述預(yù)定長度為0.2cm~0.6cm;向所述試管中加入隱窩分離液之后,于3℃~6℃下輕搖15min~35min;所述預(yù)設(shè)容積為40ml~60ml。
可選地,將所述第三上清液進(jìn)行離心處理的過程中,離心機(jī)的轉(zhuǎn)速為300×g,離心處理的時間為3min~7min,離心處理的溫度為2℃~6℃;對重懸后的所述腸道細(xì)胞進(jìn)行離心處理的過程中,離心機(jī)的轉(zhuǎn)速為300×g,離心處理的時間為3min~7min,離心處理的溫度為2℃~6℃。
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