[發(fā)明專利]腸道類器官定向分化潘氏細(xì)胞的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202111654672.0
• 申請日: 2021-12-30
• 公開（公告）號: CN114480274A
• 公開（公告）日: 2022-05-13
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 康樂;方雪;吳佳藝;宋銥航;賀子軒
• 申請（專利權(quán)）人: 中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院
• 主分類號: C12N5/078
• 分類號: C12N5/078;C12N5/071
• 代理公司: 上海和華啟核知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31339
• 代理人: 王仙子

本發(fā)明提供一種腸道類器官定向分化潘氏細(xì)胞的方法，包括如下步驟：獲取腸道類器官；將所述腸道類器官置入類器官培養(yǎng)基中；于所述類器官培養(yǎng)中加入DAPT和CHIR99021，對所述類器官培養(yǎng)基中的所述腸道類器官刺激預(yù)設(shè)時間。本發(fā)明的腸道類器官定向分化潘氏細(xì)胞的方法，通過在所述類培養(yǎng)基中加入DAPT和CHIR99021，可以在短時間內(nèi)獲取大量的、高純度的潘氏細(xì)胞。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及動物類器官培養(yǎng)領(lǐng)域，特別是涉及一種腸道類器官定向分化潘氏細(xì)胞的方法。

背景技術(shù)

潘氏細(xì)胞是位于小腸及近端結(jié)腸隱窩基底部獨(dú)特的上皮細(xì)胞，雖然數(shù)量較少，但通過其分泌防御素、溶菌酶等為機(jī)體抵抗病原微生物，調(diào)節(jié)宿主免疫功能起到重要作用。此外，亦有研究證實(shí)潘氏細(xì)胞還有其他重要的功能，例如，潘氏細(xì)胞為Lgr5陽性干細(xì)胞提供必須的生境信號、潘氏細(xì)胞與腸道腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)等。關(guān)于潘氏細(xì)胞的功能還有許多尚未探索的領(lǐng)域，所以，亟待找尋一種方法可以在體外獲得大量潘氏細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)的研究。

類器官技術(shù)，成為近年來生物、醫(yī)學(xué)界最熱門的前沿技術(shù)之一。腸道類器官是一種三維的腸道細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，能夠在實(shí)驗室中利用人或動物的腸道干細(xì)胞增殖、分化為器官特異性細(xì)胞集合，并且以與體內(nèi)相近的方式，經(jīng)細(xì)胞分序及空間限制性系統(tǒng)進(jìn)行分化，從而完成自我更新、自我組建。現(xiàn)主要應(yīng)用于疾病模型的建立、藥物的篩選及檢測以及再生醫(yī)學(xué)方面的研究。然而，類器官培養(yǎng)技術(shù)也存在其局限性，由于體外培養(yǎng)的腸道類器官分化不可控性，使得類器官中混雜有分化為各種類型的腸道細(xì)胞，這成為了定向獲取大量的潘氏細(xì)胞的技術(shù)難題。

發(fā)明內(nèi)容

為實(shí)現(xiàn)上述目的及其他相關(guān)目的，本發(fā)明提供一種腸道類器官定向分化潘氏細(xì)胞的方法，包括如下步驟：獲取腸道類器官；將所述腸道類器官置入類器官培養(yǎng)基中；于所述類器官培養(yǎng)中加入DAPT和CHIR99021，對所述類器官培養(yǎng)基中的所述腸道類器官刺激預(yù)設(shè)時間。

可選地，所述預(yù)設(shè)時間為5～10天。

可選地，所述獲取腸道類器包括如下步驟：

取小腸，用冷PBS沖洗腸管若干次，去除腸內(nèi)容物；

將所述腸管縱行切開，在剪成預(yù)定長度的腸段；

將所述腸段移入裝有PBS的試管中；

晃動所述試管清洗，析出第一上清液，并去除第一上清液；

重復(fù)上一步驟若干次，直到所述第一上清液清亮；

棄掉最后得到的所述第一上清液；

向所述試管中加入隱窩分離液輕搖，以析出第二上清液；

去除所述第二上清液；

向所述試管中加入PBS，晃動試管，以析出第三上清液，觀察是否有腸道單元，并收集所述第三上清液；

重復(fù)上述步驟，直至收集到預(yù)設(shè)容積的所述第三上清液；

將所述第三上清液進(jìn)行離心處理，以得到腸道細(xì)胞；

使用洗滌液重懸所述腸道細(xì)胞，并對重懸后的所述腸道細(xì)胞進(jìn)行離心處理，以得到所述腸道類器官；

重復(fù)上一步驟。

可選地，用所述冷PBS沖洗所述腸管的次數(shù)為3～4次；所述預(yù)定長度為0.2cm～0.6cm；向所述試管中加入隱窩分離液之后，于3℃～6℃下輕搖15min～35min；所述預(yù)設(shè)容積為40ml～60ml。

可選地，將所述第三上清液進(jìn)行離心處理的過程中，離心機(jī)的轉(zhuǎn)速為300×g，離心處理的時間為3min～7min，離心處理的溫度為2℃～6℃；對重懸后的所述腸道細(xì)胞進(jìn)行離心處理的過程中，離心機(jī)的轉(zhuǎn)速為300×g，離心處理的時間為3min～7min，離心處理的溫度為2℃～6℃。