[發明專利]腸道類器官定向分化潘氏細胞的方法

在審

• 申請號: 202111654672.0
• 申請日: 2021-12-30
• 公開（公告）號: CN114480274A
• 公開（公告）日: 2022-05-13
• 發明（設計）人: 康樂;方雪;吳佳藝;宋銥航;賀子軒
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍海軍軍醫大學第一附屬醫院
• 主分類號: C12N5/078
• 分類號: C12N5/078;C12N5/071
• 代理公司: 上海和華啟核知識產權代理有限公司 31339
• 代理人: 王仙子

1.一種腸道類器官定向分化潘氏細胞的方法，其特征在于，包括如下步驟：

獲取腸道類器官；

將所述腸道類器官置入類器官培養基中；

于所述類器官培養中加入DAPT和CHIR99021，對所述類器官培養基中的所述腸道類器官刺激預設時間。

2.根據權利要求1所述的腸道類器官定向分化潘氏細胞的方法，其特征在于：所述預設時間為5～10天。

3.根據權利要求1所述的腸道類器官定向分化潘氏細胞的方法，其特征在于：所述獲取腸道類器包括如下步驟：

取小腸，用冷PBS沖洗腸管若干次，去除腸內容物；

將所述腸管縱行切開，在剪成預定長度的腸段；

將所述腸段移入裝有PBS的試管中；

晃動所述試管清洗，析出第一上清液，并去除第一上清液；

重復上一步驟若干次，直到所述第一上清液清亮；

棄掉最后得到的所述第一上清液；

向所述試管中加入隱窩分離液輕搖，以析出第二上清液；

去除所述第二上清液；

向所述試管中加入PBS，晃動試管，以析出第三上清液，觀察是否有腸道單元，并收集所述第三上清液；

重復上述步驟，直至收集到預設容積的所述第三上清液；

將所述第三上清液進行離心處理，以得到腸道細胞；

使用洗滌液重懸所述腸道細胞，并對重懸后的所述腸道細胞進行離心處理，以得到所述腸道類器官；

重復上一步驟。

4.根據權利要求3所述的腸道類器官定向分化潘氏細胞的方法，其特征在于：用所述冷PBS沖洗所述腸管的次數為3～4次；所述預定長度為0.2cm～0.6cm；向所述試管中加入隱窩分離液之后，于3℃～6℃下輕搖15min～35min；所述預設容積為40ml～60ml。

5.根據權利要求3所述的腸道類器官定向分化潘氏細胞的方法，其特征在于：將所述第三上清液進行離心處理的過程中，離心機的轉速為300×g，離心處理的時間為3min～7min，離心處理的溫度為2℃～6℃；對重懸后的所述腸道細胞進行離心處理的過程中，離心機的轉速為300×g，離心處理的時間為3min～7min，離心處理的溫度為2℃～6℃。

6.根據權利要求3所述的腸道類器官定向分化潘氏細胞的方法，其特征在于：所述洗滌液包括DMEM、BSA及雙抗。

7.根據權利要求1至6中任一項所述的腸道類器官定向分化潘氏細胞的方法，其特征在于：所述將所述腸道類器官置入類器官培養基中包括：

根據比例用類器官培養基和基質膠重懸所述腸道類器官，以得到類器官懸液；

將所述類器官懸液懸空滴入培養孔內。