[發明專利]用于檢測多巴胺D3靶點化合物生物學活性的細胞系和方法

在審

• 申請號: 202111652413.4
• 申請日: 2021-12-30
• 公開（公告）號: CN114369578A
• 公開（公告）日: 2022-04-19
• 發明（設計）人: 葉飄;錢蕓;吳鳴;葛玉強;張藝婷;胡志京;萬澤紅
• 申請（專利權）人: 上海樞境生物科技有限公司;江蘇恩華藥業股份有限公司
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/12;C12N15/53;C12Q1/02;G01N21/64;C12R1/91
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本發明公開了一種用于檢測多巴胺D3靶點化合物生物學活性的細胞系，所述細胞系包括編碼多巴胺D3受體蛋白的多核苷酸以及編碼由CRE轉錄調控元件控制表達的熒光素酶的多核苷酸。本發明還公開了一種使用所述細胞系檢測多巴胺D3靶點化合物生物學活性的方法。本發明的細胞系可快速、準確、高效的檢測多巴胺D3靶點治療藥物的生物學活性。此外本發明檢測方法無需復雜的儀器或操作步驟，便可完全滿足針對多巴胺D3受體的小分子化合物的生物學活性檢測。

技術領域

本發明屬于生物醫藥技術領域，具體地說，本發明涉及一種包括編碼多巴胺D3受體蛋白的多核苷酸和編碼由CRE轉錄調控元件控制表達的熒光素酶的多核苷酸的用于檢測多巴胺D3靶點化合物生物學活性的細胞系；本發明還涉及一種使用所述細胞系檢測多巴胺D3靶點化合物生物學活性的檢測方法。

背景技術

多巴胺能系統在神經調節中起著重要的作用，如運動控制、動機、獎賞、認知功能、母性和生殖行為。多巴胺(Dopamine)是一種神經遞質，通過酪氨酸的連續羥基化和脫羧化在神經元末梢產生，并通過囊泡單胺轉運體2裝載到突觸囊泡中胞吐釋放。釋放的多巴胺可以被多巴胺轉運蛋白重新攝取，也可以被兒茶酚-O-甲基轉移酶和突觸前單胺氧化酶降解。多巴胺與位于靶細胞膜上的多巴胺受體結合，從而發揮作用。

多巴胺受體屬于GPCRs超家族，主要包括D1、D2、D3、D4和D5五種類型。其中，D1和D2是大腦中表達最多的多巴胺受體，并且它們幾乎不在同一細胞中同時表達。根據多巴胺受體的結構和藥理特性，它可分為兩大類：D1類受體，包括D1和D5；D2類受體，包括D2、D3和D4。所有的多巴胺受體都是代謝型受體，其中D1和D5受體與G_αs/olf蛋白偶聯，刺激第二信使cAMP的產生；D2、D3和D4受體與_Gαi/o蛋白偶聯，抑制細胞內cAMP的生成。

D1受體主要表達于尾殼核(CPu)，伏隔核(Acb)，視束(OT)，腦皮層(Cx)和杏仁核。D5受體和D1受體相比表達局限，僅在海馬，外側乳頭體核和下丘腦束旁核表達。D2受體主要在腦的CPu，OT和Acb中表達，在黑質和腹側被蓋部(VTA)也有表達，這些區域發出多巴胺纖維，提示D2受體有突觸前定位。相反，D1類受體只有廣泛的突觸后定位。在腦外，D2受體還定位于視網膜，腎臟，血管系統和垂體。D3受體的分布僅限于Callija島，隔核，下丘腦和丘腦，以及小腦中的某些區域。D3受體還分布于黑質致密部，提示它也存在突觸前定位。在前額葉皮層，杏仁核，嗅球，海馬，丘腦和中腦可見D4受體的mRNA高度表達。

目前，對于多巴胺受體激活的信號轉導途徑主要包括有：對腺苷酸環化酶的激活，或抑制鈣信號的調控。D1類受體正性調控環磷酸腺苷(cAMP)的水平。進一步激活蛋白激酶A(PKA)，PKA磷酸化細胞質和細胞核因子，調控細胞代謝包括離子通道功能，使跨膜G蛋白偶聯受體去敏感化，導致細胞神經遞質釋放。D2類受體普遍抑制腺苷酸環化酶(AC)活動。首先在垂體和紋狀體細胞發現D2類受體抑制cAMP水平。D2受體通過偶聯信號通路抑制AC，并可被百日咳毒素(PTX)阻斷。D3受體在幾個細胞株中抑制內源性cAMP水平，但抑制程度低于D2受體。有報道，D4受體抑制視網膜和一些細胞株的cAMP的聚集。

大量研究表明D3受體與情緒、認知、精神、運動控制等關系密切。對精神分裂癥患者的尸檢研究表明，患者中腦邊緣區和紋狀體D3密度升高程度顯著，而給予抗精神分裂藥物治療的患者，其D3表達相對正常；D3基因第一外顯子Ser9gly的多態性與精神分裂癥發病率密切關聯；D3基因敲除小鼠在精神分裂癥動物模型中的研究表明，區別于D2阻斷，D3拮抗劑可有效避免運動障礙等EPS副反應的發生；選擇性阻斷D3受體而較少作用于D2受體，有助于改善認知功能。根據以上研究結果，多巴胺D3受體迅速成為抗精神分裂癥新藥研究的潛在靶點，國內外學術界普遍認為藥物選擇性作用于D3，不僅有利于患者認知功能改善，且其療效尤其是避免不良反應方面將較之D2靶點藥物更具優勢。上述假設不斷推動D3與精神分裂癥相關病理機制的研究和D3靶點藥物研發。