[發(fā)明專(zhuān)利]一種蜜蜂真菌中的雙鏈RNA病毒的分離純化方法及其應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202111646906.7
• 申請(qǐng)日: 2021-12-29
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN114317457A
• 公開(kāi)（公告）日: 2022-04-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 侯春生;程雪芬;鄧炎春;楊卅
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類(lèi)研究所
• 主分類(lèi)號(hào): C12N7/00
• 分類(lèi)號(hào): C12N7/00;C12N7/02;C12R1/92
• 代理公司: 長(zhǎng)沙智路知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 43244
• 代理人: 陳建國(guó)

本發(fā)明公開(kāi)了一種蜜蜂真菌中的雙鏈RNA病毒的分離純化方法及其應(yīng)用，方法包括：S1、將蜜蜂真菌經(jīng)液氮研磨后，加入裂解液震蕩處理后，離心分離取上清液；S2、往步驟S1中的上清液中加入結(jié)合液，混勻后離心，收集上清液備用；S3、將步驟S2中的上清液加入到吸附柱中，進(jìn)行可逆性吸附；S4、通過(guò)加入洗脫液進(jìn)行分段洗脫，回收得到雙鏈RNA病毒。與傳統(tǒng)分離純化dsRNA病毒不同，本發(fā)明所提供的分離純化方法獲取dsRNA病毒更方便、快速且濃度高，完全滿足后續(xù)分子實(shí)驗(yàn)要求，采用細(xì)胞裂解的方式，避免在提取過(guò)程中使用苯酚和氯仿等有毒試劑，為后續(xù)RT?PCR、轉(zhuǎn)染、測(cè)序等實(shí)驗(yàn)提供高質(zhì)量核酸，具有重要的理論和實(shí)際意義。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于病原菌中dsRNA提取技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，涉及一種蜜蜂真菌中的雙鏈RNA病毒的分離純化方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

真菌病毒(Mycovirus或Fungal virus)主要為RNA病毒，其次為DNA病毒；其中：RNA病毒又包含雙鏈RNA病毒(dsRNA)和單鏈RNA(ssRNA)病毒。

目前，在0-13％的曲霉中能夠檢測(cè)到dsRNA病毒，且主要通過(guò)高通量測(cè)序或超高速離心方法來(lái)檢測(cè)曲霉屬菌株中dsRNA病毒；然而，這兩類(lèi)方法的實(shí)施需要復(fù)雜的生物信息分析技術(shù)或昂貴的超高速離心設(shè)備，不僅耗費(fèi)的時(shí)間長(zhǎng)，而且工作繁瑣。高濃度及高純度dsRNA病毒，是研究dsRNA病毒遺傳、變異分析的基礎(chǔ)，過(guò)高的分析及提取成本嚴(yán)重影響曲霉菌中dsRNA病毒的后續(xù)分析。

塔賓曲霉(Aspergillus tubingensis)是誘導(dǎo)蜜蜂幼蟲(chóng)患病的一種病原真菌，該菌株屬于曲霉屬(Aspergillus)；提取和純化塔賓曲霉的雙鏈RNA病毒具有重要的理論和實(shí)際意義。

鑒于此，特提出本發(fā)明。

發(fā)明內(nèi)容

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)所存在的不足，本發(fā)明提供了一種蜜蜂真菌中的雙鏈RNA病毒的分離純化方法及其應(yīng)用。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

一種蜜蜂真菌中的雙鏈RNA病毒的分離純化方法，包括：

S1、將蜜蜂真菌經(jīng)液氮研磨后，加入裂解液震蕩處理后，離心分離取上清液；

S2、往步驟S1中的上清液中加入結(jié)合液，混勻后離心，收集上清液備用；

S3、將步驟S2中的上清液加入到吸附柱中，進(jìn)行可逆性吸附；

S4、通過(guò)加入洗脫液進(jìn)行分段洗脫，回收得到雙鏈RNA病毒。

在上述技術(shù)方案中，步驟S1中，所述裂解液為含十二烷基硫酸鈉、聚乙烯吡咯烷酮40、氯化鈉、Tris-HCl和乙二胺四乙酸的無(wú)核酸酶水。

具體地，在上述技術(shù)方案中，步驟S1中，在所述裂解液中，所述十二烷基硫酸鈉的含量為1.5-2.8wt％。

具體地，在上述技術(shù)方案中，步驟S1中，在所述裂解液中，所述聚乙烯吡咯烷酮40的含量為3.2-5wt％。

具體地，在上述技術(shù)方案中，步驟S1中，在所述裂解液中，所述氯化鈉的摩爾濃度為0.42-0.65M。

具體地，在上述技術(shù)方案中，步驟S1中，在所述裂解液中，所述Tris-HCl的摩爾濃度為85-120mM。

具體地，在上述技術(shù)方案中，步驟S1中，在所述裂解液中，所述乙二胺四乙酸的摩爾濃度為16-25mM。

優(yōu)選地，在上述技術(shù)方案中，步驟S1中，在所述裂解液的pH為7-9.5。

進(jìn)一步地，在上述技術(shù)方案中，步驟S1中，對(duì)應(yīng)于1g蜜蜂真菌的菌絲，所述裂解液的加入量為1500-2500μL。