[發(fā)明專(zhuān)利]一種蜜蜂真菌中的雙鏈RNA病毒的分離純化方法及其應(yīng)用

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202111646906.7
• 申請(qǐng)日: 2021-12-29
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN114317457A
• 公開(kāi)（公告）日: 2022-04-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 侯春生;程雪芬;鄧炎春;楊卅
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類(lèi)研究所
• 主分類(lèi)號(hào): C12N7/00
• 分類(lèi)號(hào): C12N7/00;C12N7/02;C12R1/92
• 代理公司: 長(zhǎng)沙智路知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 43244
• 代理人: 陳建國(guó)

1.一種蜜蜂真菌中的雙鏈RNA病毒的分離純化方法，其特征在于，

包括：

S1、將蜜蜂真菌經(jīng)液氮研磨后，加入裂解液震蕩處理后，離心分離取上清液；

S2、往步驟S1中的上清液中加入結(jié)合液，混勻后離心，收集上清液備用；

S3、將步驟S2中的上清液加入到吸附柱中，進(jìn)行可逆性吸附；

S4、通過(guò)加入洗脫液進(jìn)行分段洗脫，回收得到雙鏈RNA病毒。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蜜蜂真菌中的雙鏈RNA病毒的分離純化方法，其特征在于，

步驟S1中，所述裂解液為含十二烷基硫酸鈉、聚乙烯吡咯烷酮40、氯化鈉、Tris-HCl和乙二胺四乙酸的無(wú)核酸酶水；步驟S2中，所述結(jié)合液為含硫氰酸胍、氯化鉀、氯化銨和醋酸鉀的無(wú)核酸酶水。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的蜜蜂真菌中的雙鏈RNA病毒的分離純化方法，其特征在于，

步驟S1中，在所述裂解液中，

所述十二烷基硫酸鈉的含量為1.5-2.8wt％，

所述聚乙烯吡咯烷酮40的含量為3.2-5wt％，

所述氯化鈉的摩爾濃度為0.42-0.65M，

所述Tris-HCl的摩爾濃度為85-120mM，

所述乙二胺四乙酸的摩爾濃度為16-25mM；

優(yōu)選地，所述裂解液的pH為7-9.5。

4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的蜜蜂真菌中的雙鏈RNA病毒的分離純化方法，其特征在于，

步驟S1中，對(duì)應(yīng)于1g蜜蜂真菌的菌絲，所述裂解液的加入量為1500-2500μL；

優(yōu)選地，步驟S1中，在加入裂解液的同時(shí)還加入β-巰基乙醇，進(jìn)一步優(yōu)選地，對(duì)應(yīng)于1g蜜蜂真菌的菌絲，所述β-巰基乙醇的加入量為18-35μL。

5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的蜜蜂真菌中的雙鏈RNA病毒的分離純化方法，其特征在于，

步驟S2中，在所述結(jié)合液中，

所述硫氰酸胍的含量為45-58wt％，

所述氯化鉀的摩爾濃度為1.2-2.0M，

所述氯化銨的摩爾濃度為0.35-0.60M，

所述醋酸鉀的摩爾濃度為0.24-0.48M；

優(yōu)選地，所述結(jié)合液的pH為5.5-7.0。

6.根據(jù)權(quán)利要求2或5所述的蜜蜂真菌中的雙鏈RNA病毒的分離純化方法，其特征在于，

步驟S2中，對(duì)應(yīng)于1g蜜蜂真菌的菌絲，所述結(jié)合液的加入量為1.8-3.5mL。

7.根據(jù)權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述的蜜蜂真菌中的雙鏈RNA病毒的分離純化方法，其特征在于，

步驟S4中，所述分段洗脫包括：

S41、往步驟S2的結(jié)合液中加入35-40wt％的無(wú)水乙醇，混勻后加入到吸附柱中，室溫離心后，棄濾液；

S42、重復(fù)2-4次將80v％的乙醇水溶液加入到吸附柱中，室溫離心后，棄濾液；

S43、將吸附柱空管室溫離心除去殘余乙醇后，將吸附柱轉(zhuǎn)移至新的離心管中，置于超凈工作臺(tái)內(nèi)風(fēng)干；

S44、往吸附柱中央滴加經(jīng)預(yù)熱后的DEPC處理水溶解，室溫離心回收得到雙鏈RNA病毒，冷凍保存。

8.根據(jù)權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)所述的蜜蜂真菌中的雙鏈RNA病毒的分離純化方法，其特征在于，

還包括，在分段洗脫后，

S5、將回收得到雙鏈RNA病毒采用DNaseI或S1核酸進(jìn)行酶解處理，純化得到的雙鏈RNA病毒。

9.根據(jù)權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)所述的蜜蜂真菌中的雙鏈RNA病毒的分離純化方法，其特征在于，

步驟S3中，所述吸附柱為EZ-10RNA純化吸附柱。

10.權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)所述的分離純化方法在提取純化蜜蜂真菌中的雙鏈RNA病毒中的應(yīng)用。