[發明專利]一種利用高通量測序分析玉露香梨貯藏期間果實菌群落結構的方法

在審

• 申請號: 202111641027.5
• 申請日: 2021-12-29
• 公開（公告）號: CN114277176A
• 公開（公告）日: 2022-04-05
• 發明（設計）人: 張曉宇;高振峰;王麗英;張立新;張新憲;侯亞茹
• 申請（專利權）人: 山西農業大學食品科學與工程學院（山西省農業科學院農產品貯藏保鮮研究所）
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/6869;C12N15/11
• 代理公司: 北京睿智保誠專利代理事務所(普通合伙) 11732
• 代理人: 周新楣

本發明屬于果實菌群落結構分析技術領域，本發明提供了一種利用高通量測序分析玉露香梨貯藏期間果實菌群落結構的方法。本發明以不同貯藏期的玉露香梨果實為試驗材料，采用Illumina MiSeq高通量測序，分析不同貯藏時間玉露香梨果實菌群落結構組成及多樣性變化。本發明為玉露香梨貯藏過程中生物拮抗菌的篩選提供了一定的理論基礎。

技術領域

本發明涉及果實菌群落結構分析技術領域，尤其涉及一種利用高通量測序分析玉露香梨貯藏期間果實菌群落結構的方法。

背景技術

玉露香梨是山西省果農規模化生產的首要果品，具有皮薄、肉細、核小、可食率高、含糖量高等諸多優點，被國家梨產業體系專家公認為“中國第一梨”。然而因其果皮薄，營養物質豐富，在貯運過程中易受微生物侵染致病，常發的病害有梨黑星病、梨果肉褐變病、梨輪紋病、梨褐腐病、梨軟腐病等，嚴重影響了果品的商品價值。

目前，梨采后病害已成為制約玉露香梨產業健康發展的重要因素，實際生產上一般采用化學農藥防治，但農藥的過量使用會導致病原菌產生耐藥性，而且帶來的農藥殘留以及環境污染，給梨果的綠色安全生產帶來很大的威脅和風險。玉露香梨的生物防治的基礎研究起步較晚，雖然在研究方法和思路上可以參考鴨梨、酥梨等，但是對梨果采后不同時期菌群落結構及多樣性的研究尚未見報道。高通量測序技術為微生物多樣性研究提供了更加可靠的技術支撐，目前已廣泛應用于農業、工業、醫療、食品等領域。如何利用高通量測序技術分析玉露香梨采后不同時期菌群落結構及多樣性對于玉露香梨果實品質及商品價值的提升具有重要意義。

發明內容

為克服現有技術中存在的上述缺陷，本發明以不同貯藏期的玉露香梨果實為試驗材料，提供了一種利用IlluminaMiSeq高通量測序分析玉露香梨貯藏期間果實菌群落結構的方法。

為了實現上述發明目的，本發明提供以下技術方案：

本發明提供了一種利用高通量測序分析玉露香梨貯藏期間果實菌群落結構的方法，包括如下步驟：

(1)將玉露香梨貯藏，每隔28～32d取樣一次，共取樣3～5次，得不同的玉露香梨樣本；

(2)分別提取上述不同玉露香梨樣本的微生物組總DNA，對所述微生物組總DNA進行PCR擴增，得PCR擴增產物；

(3)用上述所得的PCR擴增產物構建測序文庫；

(4)對上述測序文庫進行高通量測序，對測序數據進行OTU統計獲得玉露香梨貯藏期間果實的菌群落結構。

優選的，步驟(1)中所述貯藏的溫度為-2～2℃，所述貯藏的濕度為80～90％。

優選的，步驟(2)中所述PCR擴增的體系為步驟(2)中所述PCR擴增的體系為DNA 3～5μL，正向引物1～3μL，反向引物1～3μL，Premix Tap24～26μL和ddH₂O 16～18μL，所述正向引物序列如SEQ ID NO.1所示，所述反向引物序列如SEQ ID NO.2所示。

優選的，步驟(2)中所述PCR擴增的條件為93～95℃預變性4～6min，93～95℃變性50～60s，45～55℃退火45～55s，70～75℃延伸50～60s，循環30～35次，70～75℃延伸8～12min。

優選的，步驟(4)所述高通量測序過程中，目的片段的長度為200～500bp。

本發明的有益效果如下：