[發(fā)明專利]一種用于基因組目標區(qū)域測序的雜交捕獲試劑盒、捕獲方法及應(yīng)用

在審

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• 申請日: 2021-12-28
• 公開（公告）號: CN114480579A
• 公開（公告）日: 2022-05-13
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 馮延葉;孫大坤;柴智;劉會珍;孫揚
• 申請（專利權(quán)）人: 上海英基生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6813
• 分類號: C12Q1/6813;C12Q1/6806;C40B50/06;C12Q1/6869
• 代理公司: 北京金智普華知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11401
• 代理人: 張曉博

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種用于基因組目標區(qū)域測序的雜交捕獲試劑盒、捕獲方法及應(yīng)用。本發(fā)明提供的試劑盒適用于多種不同來源的基因組文庫，能夠有效降低實驗成本，提高捕獲效率，適用于基因組目標區(qū)域測序。實驗證明，本發(fā)明提供的試劑盒與市售的幾種同類試劑盒相比，在捕獲效率和均一性等方面均表現(xiàn)較好。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種用于基因組目標區(qū)域測序的雜交捕獲試劑盒、捕獲方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)

近些年來，隨著測序技術(shù)快速發(fā)展，高通量和高準確性的二代測序技術(shù)(NGS)正在得到越來越廣泛的應(yīng)用。高通量測序使得測序成本大幅降低。然而，就目前來看，全基因組重測序的成本依舊很高，且得到的海量數(shù)據(jù)給后續(xù)的分析帶來諸多不便，使其無法大規(guī)模的應(yīng)用。靶向測序技術(shù)可以將感興趣的基因組區(qū)域富集起來進行測序，使得測序數(shù)據(jù)產(chǎn)出大大減少，數(shù)據(jù)分析簡便快速，更能經(jīng)濟高效地發(fā)揮高通量測序的技術(shù)優(yōu)勢。靶向測序技術(shù)正因其準確經(jīng)濟高效的優(yōu)勢逐步改變傳統(tǒng)臨床診斷領(lǐng)域，包括遺傳病輔助診斷、無創(chuàng)單基因病診斷、腫瘤伴隨診斷、病原體檢測等方面。

靶向測序技術(shù)從技術(shù)原理上可分為兩種，包括雜交捕獲測序和多重擴增子測序。具體的，多重擴增子測序是針對感興趣的基因組區(qū)域，設(shè)計多重PCR引物進行擴增富集，然后進行測序的技術(shù)。該方法通常適用于檢測幾十到幾千個位點，或較小的目標區(qū)域。而雜交捕獲測序不受目標區(qū)域尺寸的限制，目前應(yīng)用較多的主要是液相雜交捕獲測序，即基于堿基互補配對原理設(shè)計合成核酸探針，基于液相環(huán)境對DNA文庫進行目標區(qū)域的雜交捕獲并富集，然后進行測序。

影響捕獲特異性的因素有很多，如探針的設(shè)計與合成工藝，封閉試劑的封閉性能，雜交捕獲的試劑和條件，洗脫試劑的洗脫效果，擴增試劑的擴增效率等。目前使用液相雜交捕獲技術(shù)的商業(yè)化試劑盒有多種，但主要以國外行業(yè)巨頭公司為主，價格高昂。國內(nèi)產(chǎn)品普遍存在捕獲效率偏低的問題，這使得樣本的有效數(shù)據(jù)量降低，無形中增加了單個樣本的試劑成本，難以滿足目前的靶向測序的需求。因此，需要一種成本更低，重復(fù)性高，操作簡便，捕獲效率高的雜交捕獲試劑盒。

發(fā)明內(nèi)容

針對現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明提供了一種用于基因組目標區(qū)域測序的雜交捕獲試劑盒、捕獲方法及應(yīng)用，目的在于解決現(xiàn)有技術(shù)中的一部分問題或至少緩解現(xiàn)有技術(shù)中的一部分問題。

本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的，一種用于基因組目標區(qū)域測序的雜交捕獲試劑盒，包括：封閉試劑、雜交試劑、捕獲探針、捕獲磁珠和磁珠清洗試劑、洗脫試劑和PCR擴增試劑；所述封閉試劑包括重復(fù)序列封閉試劑Human Cot DNA(15279011，Invitrogen)和接頭序列封閉試劑Universal Blockers，可根據(jù)文庫測序平臺選擇相應(yīng)的Universal Blockers。

進一步地，所述雜交試劑包括雜交緩沖液和雜交緩沖液增強劑；所述雜交緩沖液包括SSPE、Denhandt’s、EDTA、SDS、甜菜堿、四甲基氯化銨、硫酸葡聚糖；所述雜交緩沖液增強劑包括甲酰胺和硫氰酸胍。

進一步地，所述雜交緩沖液包括2x SSPE、5x Denhandt’s、2mM EDTA、0.02％SDS、2M甜菜堿、1M四甲基氯化銨、10％硫酸葡聚糖。所述雜交緩沖液增強劑配比為：甲酰胺(v％)：硫氰酸胍(6M，v％)為8:1。進一步地，所述捕獲磁珠為鏈霉素親和磁珠；所述磁珠清洗試劑包括NaCl，Tris-HCl，EDTA，Tween-20。

進一步地，所述洗脫試劑包括High Stringency Buffer、Low StringencyBuffer、Washing BufferⅠ、Washing BufferⅡ；Stringency Buffer包含SSC(檸檬酸鈉緩沖液)和SDS；Washing Buffer包含SSC。

進一步地，所述PCR擴增試劑包括DNA聚合酶、dNTP、反應(yīng)緩沖液和擴增引物，可根據(jù)文庫測序平臺選擇相應(yīng)的擴增引物。

本發(fā)明還提供了一種雜交捕獲方法，包括以下步驟：