[發明專利]一種用于基因組目標區域測序的雜交捕獲試劑盒、捕獲方法及應用

在審

• 申請號: 202111632104.0
• 申請日: 2021-12-28
• 公開（公告）號: CN114480579A
• 公開（公告）日: 2022-05-13
• 發明（設計）人: 馮延葉;孫大坤;柴智;劉會珍;孫揚
• 申請（專利權）人: 上海英基生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6813
• 分類號: C12Q1/6813;C12Q1/6806;C40B50/06;C12Q1/6869
• 代理公司: 北京金智普華知識產權代理有限公司 11401
• 代理人: 張曉博

1.一種用于基因組目標區域測序的雜交捕獲試劑盒，其特征在于，包括：封閉試劑、雜交試劑、捕獲探針、捕獲磁珠和磁珠清洗試劑、洗脫試劑和PCR擴增試劑；所述封閉試劑包括重復序列封閉試劑Human Cot DNA和接頭序列封閉試劑Universal Blockers；

所述雜交試劑包括雜交緩沖液和雜交緩沖液增強劑；所述雜交緩沖液包括SSPE、Denhandt’s、EDTA、SDS、甜菜堿、四甲基氯化銨、硫酸葡聚糖；所述雜交緩沖液增強劑包括甲酰胺和硫氰酸胍；甜菜堿與四甲基氯化銨的濃度比為2：1。

2.根據權利要求1所述的一種用于基因組目標區域測序的雜交捕獲試劑盒，其特征在于：所述雜交緩沖液包括2x SSPE、5x Denhandt’s、2mM EDTA、0.02％SDS、2M甜菜堿、1M四甲基氯化銨、10％硫酸葡聚糖。

3.根據權利要求2所述的一種用于基因組目標區域測序的雜交捕獲試劑盒，其特征在于：所述雜交緩沖液增強劑配比為：甲酰胺(v％)：硫氰酸胍(6M，v％)為8:1。

4.根據權利要求1所述的一種用于基因組目標區域測序的雜交捕獲試劑盒，其特征在于：所述捕獲磁珠為鏈霉素親和磁珠；所述磁珠清洗試劑包括NaCl，Tris-HCl，EDTA，Tween-20。

5.根據權利要求1所述的一種用于基因組目標區域測序的雜交捕獲試劑盒，其特征在于：所述洗脫試劑包括High Stringency Buffer、Low Stringency Buffer、WashingBuffer Ⅰ、Washing Buffer Ⅱ；Stringency Buffer包含SSC和SDS；Washing Buffer包含SSC。

6.根據權利要求1所述的一種用于基因組目標區域測序的雜交捕獲試劑盒，其特征在于：所述PCR擴增試劑包括DNA聚合酶、dNTP、反應緩沖液和擴增引物。

7.一種基于權利要求1-6任一所述的試劑盒的雜交捕獲方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)封閉試劑與文庫混合后濃縮；

(2)向(1)獲得混合物中加入雜交試劑和捕獲探針混勻，探針與目標區域雜交；

(3)向(2)所得產物中加入清洗后的捕獲磁珠，進行捕獲；

(4)熱洗脫和常溫洗脫；

(5)步驟(4)的產物進行PCR擴增和純化。

8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于：步驟(1)中，封閉試劑與文庫的用量分別為DNA library 500ng；Human Cot DNA 5ul；Universal Blockers 2ul；步驟(2)中試劑用量分別為雜交緩沖液8.5ul；雜交緩沖液增強劑2.7ul；捕獲探針4ul；Nuclease-Free Water1.8ul；步驟(5)中，擴增體系包括：洗脫后結合于磁珠上的捕獲文庫20ul；PCR Primers1.25ul；HiFi PCR Mix 25ul；Nuclease-Free Water 3.75ul。

9.根據權利要求8所述的方法，其特征在于：步驟(2)中，混勻后室溫孵育5～10min，然后運行如下程序：95℃30sec，65℃4～16hr，65℃Hold；步驟(3)中，捕獲反應條件包括：熱蓋75℃，65℃孵育45min；每10～12min取出PCR管進行振蕩混勻；步驟(5)中，擴增程序包括：98℃45s；98℃15s，60℃30s，72℃30s，6-14個循環；72℃1min；4℃Hold。

10.如權利要求1-6任一所述的試劑盒，或權利要求8或9所述的方法在目標序列雜交捕獲中的應用。