[發明專利]適配體功能化UCST型溫敏嵌段聚合物及其同步分離純化、固定化細胞色素C的應用

在審

• 申請號: 202111624169.0
• 申請日: 2021-12-28
• 公開（公告）號: CN114349919A
• 公開（公告）日: 2022-04-15
• 發明（設計）人: 劉園園;李利利;蘭會玲;王蕾;韓娟;王赟;劉怡涵
• 申請（專利權）人: 江蘇大學
• 主分類號: C08F293/00
• 分類號: C08F293/00;C08F8/32;C07K14/80;C07K1/14;C07K17/08
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本發明的目的在于提供一種適配體功能化UCST型溫敏嵌段聚合物的制備方法，及其同步分離純化、固定化細胞色素C(Cyt c)的應用。本發明結合了適配體對酶的高特異性識別、高親和力以及UCST型溫敏嵌段聚合物的溫度刺激響應性能，突破了現有分離純化技術的局限性，實現了豬心肌細胞粗提液中Cyt c的高效、選擇性同步分離純化、固定化。在最優條件下，Cyt c的分離效率為90.2％，所得的固定化Cyt c在高溫、堿性環境中展現出了良好的穩定性，并表現出均相催化、異相高效、快速回收的優勢。本發明制備的適配體功能化UCST型溫敏嵌段聚合物可廣泛應用于高效、選擇性同步分離純化、固定化酶，是降低工業用酶成本的有效方法。

技術領域

本發明屬于聚合物及其制備方法技術領域，涉及適配體功能化UCST型溫敏聚合物的制備及其同步分離純化、固定化細胞色素C(Cyt c)的應用。

背景技術

酶制劑主要是從動物、植物、微生物體中提取、分離、純化、加工得到的一定純度、催化活性的蛋白質產品。酶粗提液中含有大量的雜蛋白、小分子糖、氨基酸等組分，要從組分復雜的粗提液中分離純化得到較高純度的目標酶極具挑戰。常用的分離方法為先采用鹽析沉淀法、有機溶劑沉淀法等粗級分離方法，去除大部分雜質；其次，采用膜分離、層析技術、電泳分離等細級分離方法，獲得較高純度酶。這些傳統的分離方法具有操作復雜、分離成本高等缺點，無法滿足簡單、高效分離純化酶的需求。酶的結構易受到溫度、酸堿度、有機溶劑等因素影響而失去催化活性，并且酶具有穩定性差、不能重復使用等缺點限制了其工業化應用。因此，酶的同步分離純化、固定化研究逐漸成為研究的新方向。基于標簽與活性基團的特異性相互作用，通過重組DNA技術在靶蛋白引入標簽，同時在載體材料上修飾活性基團，可達到從粗提液中同步分離純化、固定化靶蛋白的目的。可在實際操作過程中，仍存在操作復雜、成本高等不足。急需發展高效、選擇性從酶粗提液中直接同步分離純化、固定化酶的方法。

適配體是一類經過人工合成并從寡核苷酸文庫篩選出來的單鏈核苷酸(ssDNA和ssRNA)。適配體在結合靶分子時會首先自適應折疊形成相應的識別結構，如發夾、凸環等，然后通過形狀匹配、靜電、氫鍵等多重作用力高特異性識別作用靶分子。研究表明，當靶分子是大分子蛋白質的時候，適配體能通過多位點結合蛋白質，使適配體-蛋白質復合物的解離常數達到皮摩爾級，結合接近不可逆結合。基于適配體高特異性識別、高親和力，可將其作為親和配體接枝到載體材料上，達到同步分離純化、固定化酶的目的。

合適的固定化酶載體可以顯著改善固定化酶的特性，具有最高臨界相轉變溫度(UCST)的溫敏聚合物，在感受到外部環境溫度變化時，可以實現從可溶狀態到不可溶狀態的可逆相變。以該類聚合物作為固定化酶的載體材料，可通過溫度刺激響應實現固定化酶高效、快速的回收和循環利用。因此，為實現直接從酶粗提液中高效、選擇性的同步分離純化、固定化酶，可將具有高特異性識別和高親和力的適配體修飾到UCST型溫敏聚合物，制備適配體功能化UCST型溫敏聚合物，以有效降低酶制劑的生產和應用成本，同時通過適配體的自適應性構象改變保持酶的活性。

發明內容