[發(fā)明專利]PIK3CA基因和BRAF基因突變多重檢測(cè)引物探針及其試劑盒

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202111617387.1
• 申請(qǐng)日: 2021-12-28
• 公開（公告）號(hào): CN114214412A
• 公開（公告）日: 2022-03-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 洪專;潘文健
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 普瑞斯新（上海）生物醫(yī)療科技有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/6886
• 分類號(hào): C12Q1/6886;C12N15/11
• 代理公司: 常州市江海陽(yáng)光知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 32214
• 代理人: 蔣欣

本發(fā)明涉及一種PIK3CA基因和BRAF基因突變多重檢測(cè)引物探針及其試劑盒包括檢測(cè)PIK3CA基因和BRAF基因20號(hào)外顯子T790M突變的上游引物F?T790M、下游引物R?T790M、野生型探針WP?T790和突變型探針MP?T790M，檢測(cè)PIK3CA基因和BRAF基因21號(hào)外顯子L858R突變的上游引物F?L858R、下游引物R?L858R、野生型探針WP?L858和突變型探針MP?L858R，以及檢測(cè)PIK3CA基因和BRAF基因19號(hào)外顯子片段缺失突變的上游引物F?E19del、下游引物R?E19del、野生型探針WP?E19和突變型探針MP?E19del。本發(fā)明的PIK3CA基因和BRAF基因突變多重檢測(cè)引物探針及其試劑盒快速高效，標(biāo)準(zhǔn)品的配制簡(jiǎn)單，檢測(cè)體系的特異性與靈敏度高，游離DNA的利用率高，準(zhǔn)確度高。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種PIK3CA基因和BRAF基因突變檢測(cè)產(chǎn)品，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

EGFR基因主要有兩條下游的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，其中第一條通路是是Ras/Raf/MEK/ERK-MAPK通路。PIK3CA基因?qū)儆谥|(zhì)激酶編碼基因，在結(jié)直腸癌、卵巢癌和乳腺癌、胃癌、肝癌、肺癌等多種腫瘤中屬于發(fā)生高頻體細(xì)胞突變基因。絲裂原激活蛋白激酶(MAPK)信號(hào)通路中編碼效應(yīng)因子的基因激活體細(xì)胞改變的頻率很高(70％)，包括點(diǎn)突變磷酸肌醇3-激酶(PI3K)通路的成員，如PTEN、PIK3CA和AKT1。有研究指出PIK3CA基因突變，是除HER2基因擴(kuò)增、p53基因突變之外乳腺癌常見基因突變之一，突變近80％發(fā)生在螺旋區(qū)和激酶區(qū)，分別對(duì)應(yīng)PIK3CA基因的第9號(hào)外顯子(E542K、E545D、E545K突變位點(diǎn))和第20號(hào)外顯子(H1047R、H1047L)。攜帶有PIK3CA基因突變的患者無(wú)法對(duì)靶向EGFR、HER2基因蛋白藥物獲益。

另一條重要的EGFR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是PI3K/Akt/mTOR通路。BRAF突變通過(guò)激活RAF-MEK-ERK通路介導(dǎo)腫瘤增殖和存活，促使細(xì)胞持續(xù)增值，抑制細(xì)胞凋亡，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的持續(xù)發(fā)展。約43-66％的已診斷的黑色素瘤攜帶BRAF突變，其中最常見的是V600E(80％)，其他變異發(fā)現(xiàn)的頻率較低；V600K(12％)、M(4％)、R(5％)和D(5％)患者內(nèi)BRAF突變的異質(zhì)性已經(jīng)在原發(fā)腫瘤和轉(zhuǎn)移之間以及不同轉(zhuǎn)移之間。BRAF基因位于級(jí)聯(lián)信號(hào)傳導(dǎo)途徑的下游，BRAF基因突變與表皮生長(zhǎng)因子受體抑制劑的藥效有關(guān)。西妥昔昔單抗和帕尼單抗等靶向單抗可用于治療BRAF基因陰性的患者，對(duì)于BRAF存在突變的患者則無(wú)效。

在對(duì)癌癥患者進(jìn)行靶向EGFR、HER2等基因進(jìn)行藥物治療前，對(duì)腫瘤患者的BRAF和PIK3CA等基因的突變狀況進(jìn)行精準(zhǔn)檢測(cè)顯得尤為重要。傳統(tǒng)的對(duì)這兩個(gè)基因進(jìn)行檢測(cè)方法多基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR),有一代測(cè)序和qPCR等。然而，傳統(tǒng)方法存在靈敏度低，對(duì)樣本類型要求較為嚴(yán)格，僅適合手術(shù)組織樣本，這樣導(dǎo)致了無(wú)法連續(xù)實(shí)時(shí)的觀測(cè)基因的突變狀況。現(xiàn)在，數(shù)字PCR(dPCR)正在改變傳統(tǒng)PCR的領(lǐng)域，并重新定義了對(duì)突變檢測(cè)的檢測(cè)下線。對(duì)于許多檢測(cè)方法，dPCR的敏感度明顯高于傳統(tǒng)的PCR分析，因此，設(shè)計(jì)多重ddPCR體系，同時(shí)高效準(zhǔn)確的檢測(cè)這兩個(gè)基因的突變狀態(tài)顯得尤為重要。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種快速高效，檢測(cè)體系的特異性與靈敏度高，游離DNA的利用率高，準(zhǔn)確度高的PIK3CA基因和BRAF基因突變多重檢測(cè)引物探針，以及采用該引物探針的試劑盒。

本發(fā)明為解決上述技術(shù)問(wèn)題提出的一種技術(shù)方案是：一種PIK3CA基因和BRAF基因突變多重檢測(cè)引物探針，包括檢測(cè)PIK3CA基因E545K突變的上游引物F-E545、下游引物R-E545、野生型探針WP-E545和突變型探針MP-E545K，檢測(cè)PIK3CA基因H1047R突變的上游引物F-H1047、下游引物R-H1047、野生型探針WP-H1047和突變型探針MP-H1047R，以及檢測(cè)BRAF基因V600E突變的上游引物F-V600、下游引物R-V600、野生型探針WP-V600和突變型探針MP-V600E；