[發明專利]一種基于熔解曲線正負峰形分析的多重PCR檢測方法及應用

有效

• 申請號: 202111593668.8
• 申請日: 2021-12-23
• 公開（公告）號: CN114317699B
• 公開（公告）日: 2023-01-10
• 發明（設計）人: 趙瑞瑞;童京京;劉淑莉;朱怡倩;曲徑
• 申請（專利權）人: 鄭州華之源醫學檢驗實驗室有限公司
• 主分類號: C12Q1/686
• 分類號: C12Q1/686;C12N15/11;C12Q1/70;C12Q1/6883
• 代理公司: 北京天盾知識產權代理有限公司 11421
• 代理人: 王漾

本發明公開了一種基于熔解曲線正負峰形分析的多重PCR檢測方法及應用，屬于基因檢測技術領域，本發明將雙標記自淬滅的TaqMan探針熔解曲線技術與兩條鄰近單標記探針聯合淬滅的熔解曲線技術相結合，提出一種基于熔解曲線正負峰形分析的多重PCR檢測方法及應用。本方法利用雙標記自淬滅的TaqMan探針熔解曲線技術，獲得正常的熔解峰，利用兩條鄰近單標記探針聯合淬滅的熔解曲線技術獲得倒置的熔解峰，實現單色熒光通道中，一個靶標的檢測結果呈現正的熔解峰，另一個靶標的檢測結果呈現負的熔解峰，使得單色熒光通道可同時檢測至少兩種靶標，本發明利用現有熒光PCR平臺有限的熒光檢測通道和在較窄的溫度范圍內單管實現多重靶標的檢測，具有較大的市場和應用前景。

技術領域

本發明涉及多重基因檢測技術領域，具體為一種基于熔解曲線正負峰形分析的多重PC R檢測方法及應用。

背景技術

多重PCR(Multiplex polymerase chain reaction，MPCR)是指通過一次PCR反應同時對多個靶標進行擴增，結合一定的檢測手段對擴增產物進行檢測從而實現對多個靶標進行診斷的技術。MPCR具有高效率、高通量、低成本的特性而被深入研究。多重PCR在微生物、遺傳病、腫瘤、藥物基因組學等學科中有著重要的應用。

多重熒光定量PCR(Multiple fluorescencequantitative PCR)技術是在熒光定量PCR技術的基礎上，利用幾種不同熒光基團的組合，結合儀器對不同通道熒光的檢測能力實現對多個靶標的實時定量檢測。TaqMan水解探針(Hydrolysisprobes)是多重熒光PCR體系中常用的一種探針，探針一端標記熒光基團，另一端標記淬滅基團，通過在不同序列末端標記不同熒光基團及相應的淬滅基團，即可形成不同的TaqMan水解探針，將上述探針及相應的擴增引物加至同一反應體系，即可實現對多個靶標的共同檢測。分子信標(Molecularbeac on)是多重PCR體系中另一種常用的探針，基于熒光共振能量轉移(Fluorescenceresonanc e energy transfer，FRET)的原理，當體系中不存在特異性的靶標時，分子信標會自發形成莖環結構，淬滅基團與熒光基團相互接近從而發生FRET，不會產生熒光。如果體系中存在特異性的靶標，在一定的條件下，莖環結構會打開并且與靶標進行復性，從而產生熒光信號。那么在同一個反應體系中加入幾種靶標特異性的分子信標就能夠實現對多個靶標的同時檢測。基于水解探針和分子信標探針的多重熒光定量PCR技術的優點是簡便快捷，然而受儀器熒光檢測通道的限制，往往最多只能達到四重或五重檢測。

非特異性的熒光染料嵌入到DNA雙鏈小溝中后，在特定的激發光激發后將會產生一定波長的熒光。以此為基礎發展了熔解曲線(Meltingcurve)分析法，利用不同DNA序列具有不同Tm(Melting temperature)值的特征，在PCR反應結束后，通過程序升溫使雙鏈逐漸解鏈成單鏈，當達到雙鏈特異的Tm值所對應的溫度時，熒光強度大幅度降低，利用這樣的原理可以對PCR中不同長度的雙鏈產物或相同長度不同GC含量的雙鏈進行分析。在熔解曲線分析技術的基礎上發展而來的高分辨率熔解曲線技術是一種利用飽和染料，借助高分辨率的儀器，實現對單個核苷酸熔解溫度不同從而形成不同形態熔解曲線，進而對基因進行分析的新技術，它具有極高的靈敏度，能夠檢測出單個堿基之間的差別，目前主要應用于單核苷酸多態性分析、甲基化分析、基因突變、基因分型等領域。但基于熒光染料的多重PCR技術由于染料不具備特異性的識別能力，所以同一反應體系中通常只能使用一種熒光染料。