[發(fā)明專利]一種基于熔解曲線正負(fù)峰形分析的多重PCR檢測方法及應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202111593668.8
• 申請日: 2021-12-23
• 公開（公告）號: CN114317699B
• 公開（公告）日: 2023-01-10
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 趙瑞瑞;童京京;劉淑莉;朱怡倩;曲徑
• 申請（專利權(quán)）人: 鄭州華之源醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室有限公司
• 主分類號: C12Q1/686
• 分類號: C12Q1/686;C12N15/11;C12Q1/70;C12Q1/6883
• 代理公司: 北京天盾知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11421
• 代理人: 王漾

1.一種基于熔解曲線正負(fù)峰形分析的多重PCR檢測方法，所述檢測方法用于非疾病治療診斷目的，其特征在于，包括如下步驟：

S1：根據(jù)靶標(biāo)基因位點(diǎn)序列，分別設(shè)計(jì)具有相同單色熒光通道的特異性上游引物、下游引物和探針序列，所述靶標(biāo)基因位點(diǎn)的數(shù)量至少為2種；每兩個(gè)靶標(biāo)基因位點(diǎn)中，靶標(biāo)基因位點(diǎn)A的探針為雙標(biāo)記自淬滅TaqMan探針，且5’端標(biāo)記熒光基團(tuán)，3’端標(biāo)記淬滅基團(tuán)，靶標(biāo)基因位點(diǎn)B的探針為兩條鄰近單標(biāo)記聯(lián)合淬滅探針P1、P2，探針P1的3’端標(biāo)記淬滅基團(tuán)，探針P2的5’端標(biāo)記熒光基團(tuán)，3’端磷酸化封閉處理，探針P1的長度大于探針P2；

S2：配制多重PCR反應(yīng)體系，所述多重PCR反應(yīng)體系包括每種所述靶標(biāo)基因的特異性探針、每種所述靶標(biāo)基因的特異性上游引物和下游引物；

S3：進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在PCR擴(kuò)增周期結(jié)束后，進(jìn)行熔解曲線分析，并根據(jù)熔解峰形狀及熔解峰Tm值的差異判斷多重單核苷酸的基因型；

步驟S1中，所述雙標(biāo)記自淬滅TaqMan探針序列長度介于18bp～30bp，T_m值介于45℃～75℃；所述單標(biāo)記探針P1序列長度介于23bp～30bp，T_m值介于50℃～75℃；單標(biāo)記探針P2序列長度介于15bp～25bp，T_m值介于45℃～70℃；

步驟S3中，靶標(biāo)基因位點(diǎn)A基于引物不對稱擴(kuò)增的方式獲得單鏈雜交產(chǎn)物，靶標(biāo)基因位點(diǎn)B則采用引物對稱擴(kuò)增的方式獲得雙鏈擴(kuò)增產(chǎn)物，通過快速降溫的方式獲得單鏈雜交產(chǎn)物，降溫速率介于0.1℃/s～4℃/s，熔解曲線程序?yàn)椋?5℃保持1min，43℃～75℃升溫并以0.04℃/s～0.06℃/s的升溫速度采集熒光信號。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于熔解曲線正負(fù)峰形分析的多重PCR檢測方法，其特征在于，所述熒光基團(tuán)選自FAM、VIC、ROX、CY5，所述淬滅基團(tuán)選自BHQ1、BHQ2、BHQ3。

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種基于熔解曲線正負(fù)峰形分析的多重PCR檢測方法，其特征在于，步驟S2中，靶標(biāo)基因位點(diǎn)A的引物探針比例為上游引物：下游引物：探針＝1：10：5；靶標(biāo)基因位點(diǎn)B的引物探針比例為上游引物：下游引物：探針P1：探針P2＝4：4：2：1。

4.如權(quán)利要求1～3任一所述的基于熔解曲線正負(fù)峰形分析的多重PCR檢測方法在檢測人類ACE基因、ADRB1基因、AGTR1基因和CYP2C9*3基因多態(tài)性檢測中的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用以非治療或非診斷為目的；所述人類ACE基因、ADRB1基因、AGTR1基因和CYP2C9*3基因多態(tài)性指的是ACE基因的rs4646994位點(diǎn)、ADRB1基因的rs1801253位點(diǎn)、 AGTR1基因的rs5186位點(diǎn)和CYP2C9*3基因的rs1057910位點(diǎn)的多態(tài)性。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的基于熔解曲線正負(fù)峰形分析的多重PCR檢測方法在檢測人類ACE基因、ADRB1基因、AGTR1基因和CYP2C9*3基因多態(tài)性檢測中的應(yīng)用，其特征在于，多重PCR檢測所需引物的序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.8所示。

6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的基于熔解曲線正負(fù)峰形分析的多重PCR檢測方法在檢測人類ACE基因、ADRB1基因、AGTR1基因和CYP2C9*3基因多態(tài)性檢測中的應(yīng)用，其特征在于，多重PCR檢測所需探針的序列如SEQ ID NO.9～SEQ ID NO.14所示。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的基于熔解曲線正負(fù)峰形分析的多重PCR檢測方法在檢測人類ACE基因、ADRB1基因、AGTR1基因和CYP2C9*3基因多態(tài)性檢測中的應(yīng)用，其特征在于，AGTR1基因的rs5186位點(diǎn)及CYP2C9*3基因的rs1057910位點(diǎn)為同一熒光通道檢測，共用ROX熒光基團(tuán)標(biāo)記；ACE基因的rs4646994位點(diǎn)及ADRB1基因的rs1801253位點(diǎn)為同一熒光通道檢測，共用CY5熒光基團(tuán)標(biāo)記。