[發明專利]一種皮膚衰老蛋白標志物—SPIT1蛋白及其無創性提取方法

在審

• 申請號: 202111591778.0
• 申請日: 2021-12-23
• 公開（公告）號: CN114252630A
• 公開（公告）日: 2022-03-29
• 發明（設計）人: 楊森;張學軍;張博
• 申請（專利權）人: 楊森
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68
• 代理公司: 北京圖億天下專利代理有限公司 11974
• 代理人: 耿巖

本發明公開了一種皮膚衰老蛋白標志物—SPIT1蛋白及其無創性提取方法。公開了SPIT1蛋白在輔助判斷衰老程度中的應用及提取檢測方法，旨在從根源上找到導致皮膚衰老的內在因素，在皮膚老化外在表現出現前提前干預皮膚衰老，另外可以正確判斷皮膚的衰老程度以及判斷衰老的生理年齡是否與實際年齡相符，為美容或者醫學美容提供參考和方向。

技術領域

本發明涉及分子生物學領域，尤其涉及一種皮膚衰老蛋白標志物—SPIT1蛋白及其無創性提取方法。

背景技術

皮膚老化，也即皮膚衰老，是指皮膚功能衰老性損傷，使皮膚對機體的防護能力，調節能力等減退，由此皮膚不能適應內外環境的變化，出現顏色、色澤、形態、質感等外觀整體狀況的改變。皮膚的老化分為內源性老化和外源性老化。內源性老化是指皮膚隨年齡增長的自然老化。表現為皮膚變白，出現細小皺紋、彈性下降、皮膚松弛等。外源性老化的最主要原因是日曬所致的光老化。表現為皺紋、皮膚松弛、粗糙、淡黃或灰黃色的皮膚變色、毛細血管擴張、色素斑形成等。

隨著人們生活水平的提高，人們越來越重視皮膚保養，但通常只是關注皮膚衰老的外在表現，比如皺紋、色斑、以及毛孔粗細程度等信息，并由此來判斷皮膚的衰老程度，這種判斷皮膚衰老程度的方法不能從根源上找到導致皮膚衰老的內在因素，無法在皮膚老化外在表現出現前提前干預皮膚衰老，另外正確判斷皮膚的衰老程度以及判斷衰老的生理年齡是否與實際年齡相符，也是美容或者醫學美容的前提。

SPINT1(SPIT1)充當HSP90AA1的伴侶。介導分子伴侶HSPA8/HSC70和HSP90的締合。能與分子伴侶結合；分別可與Hsp70蛋白、Hsp90蛋白、蛋白C末端、RNA結合。在生物過程中能細胞對白介素7的反應。酶和途徑數據庫中編碼P31948，反應組編碼R-HSA-3371497，用于類固醇激素受體(SHR)的HSP90伴侶周期。輔助生物活動生命過程。SPINT1，也稱為1型HGF激活劑(HGFA)抑制劑(HAI-1)，是可在大多數上皮細胞表面表達的Kunitz型絲氨酸蛋白酶抑制劑。SPINT1-ST14軸可調節炎癥，SPINT1水平可嚴格調節腫瘤與免疫細胞的串擾。SPINT1水平過低會導致腫瘤細胞與其微環境之間的串擾不平衡，從而促進較高的SKCM(皮膚黑素細胞瘤)侵襲性。此外，研究發現小鼠腸道特異性Spint1的缺失會誘導小鼠腸道的激活主要炎癥轉錄因子NF-κB和加速腸道腫瘤形成。缺乏Spint1的小鼠表現出嚴重的生長遲緩，并且無法在出生后第16天生存。這些小鼠在組織學上表現為表皮過度角化和棘皮癥，以及與異常角質層發育相關的發育不足。因此認為SPINT1對于維持免疫穩態，抑制腫瘤發生發展以及促進皮膚正常增殖起到重要作用。

目前沒有將SPIT1蛋白(Kunitz型蛋白酶抑制劑1)用于輔助判斷皮膚衰老程度的先例。

發明內容

一種無創提取皮膚中SPIT1蛋白的方法，該方法包括以下步驟：

(1)受試者表皮皮膚樣本取樣：將3M醫用膠貼貼于前臂曲側部位，1分鐘后，輕輕揭下3M膠貼片，得到膠帶狀皮膚樣品；

(2)干燥的肽段樣品的獲得：1)將膠帶狀皮膚樣品切成小塊，沉積在玻璃板上在轉移到離心管；

2)添加不含SDS的適量裂解緩沖液樣品，加入2mM EDTA，1XCocktail，然后放在冰5分鐘，然后，添加10mM DTT，將樣品浸泡過夜；

3)在離心力25,000g，4℃下離心15分鐘，回收上清液并用10mM處理DTT在56℃的水浴中放置1小時；

4)然后用55mM IAM處理，在室溫黑暗中孵育45分鐘，并在25,000g，4℃下離心15分鐘，得到最終的蛋白質溶液上清液；蛋白質濃度使用Bradford方法進行測量，提取的蛋白質通過12％的SDS-PAGE進行質控；每份樣品取100μg蛋白質，加入胰蛋白酶并于37℃下水解4小時；隨后再次以相同的比例添加胰蛋白酶在37℃下酶解8小時；水解產物使用Strata X色譜柱對多肽進行脫鹽并在真空下干燥，即得到干燥的肽段樣品。