[發明專利]一種皮膚衰老蛋白標志物—SPIT1蛋白及其無創性提取方法

在審

• 申請號: 202111591778.0
• 申請日: 2021-12-23
• 公開（公告）號: CN114252630A
• 公開（公告）日: 2022-03-29
• 發明（設計）人: 楊森;張學軍;張博
• 申請（專利權）人: 楊森
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68
• 代理公司: 北京圖億天下專利代理有限公司 11974
• 代理人: 耿巖

1.一種無創提取皮膚中SPIT1蛋白的方法，該方法包括以下步驟：

(1)受試者表皮皮膚樣本取樣：將3M醫用膠貼貼于前臂曲側部位，1分鐘后，輕輕揭下3M膠貼片，得到膠帶狀皮膚樣品；

(2)干燥的肽段樣品的獲得：1)將膠帶狀皮膚樣品切成小塊，沉積在玻璃板上在轉移到離心管；

2)添加不含SDS的適量裂解緩沖液樣品，加入2mM EDTA，1XCocktail，然后放在冰5分鐘，然后，添加10mM DTT，將樣品浸泡過夜；

3)在離心力25,000g，4℃下離心15分鐘，回收上清液并用10mM處理DTT在56℃的水浴中放置1小時；

4)然后用55mM IAM處理，在室溫黑暗中孵育45分鐘，并在25,000g，4℃下離心15分鐘，得到最終的蛋白質溶液上清液；蛋白質濃度使用Bradford方法進行測量，提取的蛋白質通過12％的SDS-PAGE進行質控；每份樣品取100μg蛋白質，加入胰蛋白酶并于37℃下水解4小時；隨后再次以相同的比例添加胰蛋白酶在37℃下酶解8小時；水解產物使用Strata X色譜柱對多肽進行脫鹽并在真空下干燥，即得到干燥的肽段樣品。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：表皮皮膚樣本中SPIT1蛋白基于質譜的相對含量的測定方法，包括如下步驟：(1)受試者表皮皮膚樣本取樣：將3M醫用膠貼貼于前臂曲側部位，1分鐘后，輕輕揭下3M膠貼片，得到膠帶狀皮膚樣品；

(2)干燥的肽段樣品的獲得：1)將膠帶狀皮膚樣品切成小塊，沉積在玻璃板上在轉移到離心管；

2)添加不含SDS的適量裂解緩沖液樣品，加入2mM EDTA，1XCocktail，然后放在冰5分鐘，然后，添加10mM DTT，將樣品浸泡過夜；

3)在離心力25,000g，4℃下離心15分鐘，回收上清液并用10mM處理DTT在56℃的水浴中放置1小時；

4)然后用55mM IAM處理，在室溫黑暗中孵育45分鐘，并在25,000g，4℃下離心15分鐘，得到最終的蛋白質溶液上清液；蛋白質濃度使用Bradford方法進行測量，提取的蛋白質通過12％的SDS-PAGE進行質控；每份樣品取100μg蛋白質，加入胰蛋白酶并于37℃下水解4小時；隨后再次以相同的比例添加胰蛋白酶在37℃下酶解8小時；水解產物使用Strata X色譜柱對多肽進行脫鹽并在真空下干燥，即得到干燥的肽段樣品；

(3)檢測

將干燥的肽段樣品用流動相A(2％ACN，0.1％FA)復溶，20,000g離心10分鐘后，取上清進樣；通過USPIT1蛋白LC進行分離；樣品首先進入trap柱富集并除鹽，隨后與自裝C18柱串聯，以500nl/min流速通過如下有效梯度進行：

分離：0-5min，5％流動相B(98％ACN，0.1％FA)；5-160min，流動相B從5％線性升至35％；160-170min，流動相B從35％升至80％；170-175min，80％流動相B；176-180min，5％流動相B；納升液相分離末端直接連接質譜儀；

DDA質譜檢測

經過液相分離的肽段通過nanoESI源離子化后進口到串聯質譜儀Q-Exactive HF模式檢測；主要參數設置：離子源電壓設置為1.6kV；一級質譜掃描范圍350～1500m/z；分辨率設置為60,000；二級質譜起始m/z固定為100；分辨率15,000。二級碎裂的母離子篩選條件為：電荷2+到7+，峰強度超過10,000的強度排在前20的母離子；離子碎裂模式為HCD，碎片離子在Orbitrap中進行檢測；動態排除時間設定為30s；AGC設置為：一級3E6，二級1E5；

DIA質譜檢測

經過液相分離的肽段通過nanoESI源離子化后進口到串聯質譜儀Q-Exactive HF模式檢測；主要參數設置：離子源電壓設置為1.6kV；一級質譜掃描范圍350～1500m/z；分辨率設置為120,000；將350-1500Da均分為40個窗口進行碎裂及信號采集；離子碎裂模式為HCD，碎片離子在Orbitrap中進行檢測；動態排除時間設定為30s；AGC設置為：一級3E6，二級1E5。

3.根據權利要求2所述的SPIT1蛋白測定方法，其特征在于：用于檢測SPIT1蛋白含量的物質為質譜鑒定試劑、抗體或其抗原結合片段；所述用于檢測SPIT1蛋白含量的物質為軌道阱高分辨率質譜儀。