[發(fā)明專利]一種表達酯酶EstS的大腸桿菌基因工程菌及其應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202111589724.0
• 申請日: 2021-12-23
• 公開（公告）號: CN114214261A
• 公開（公告）日: 2022-03-22
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 高蓓;魏東芝;王風清;江敏
• 申請（專利權(quán)）人: 華東理工大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/70;C12N15/55;C12P41/00;C12P17/06;C12R1/19
• 代理公司: 上海華工專利事務(wù)所(普通合伙) 31104
• 代理人: 繆利明;趙孟琴

本發(fā)明公開了一種表達酯酶EstS的大腸桿菌基因工程菌，其是將具有序列如SEQ ID NO.3所示的EstS基因序列的目的片段克隆到表達載體中，然后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞中制備獲得。本發(fā)明公開了該表達酯酶EstS的大腸桿菌基因工程菌的應(yīng)用。本發(fā)明還公開了一種微生物酶法拆分制備(S)?6?氟?色滿?2?羧酸的方法，其是以所述的表達酯酶EstS的大腸桿菌基因工程菌為催化劑，以外消旋6?氟?色滿?2?羧酸甲酯為底物，進行反應(yīng)，該方法提供了出色的立體選擇性。同時，本發(fā)明首次實現(xiàn)利用酯酶EstS拆分制備(S)?6?氟?色滿?2?羧酸。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于醫(yī)藥生物化工技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，是關(guān)于一種表達酯酶EstS的大腸桿菌基因工程菌及其拆分制備(S)-6-氟-色滿-2-羧酸的方法。

背景技術(shù)

6-氟-色滿-2-羧酸是重要醫(yī)藥中間體?；瘜W名稱是6-氟-3，4-二氫-2H-1-苯并吡喃-2-甲酸，化學分子式是C₁₀H₉O₃F分子量是196.18，結(jié)構(gòu)式為：

在許多具有生物活性的分子結(jié)構(gòu)中，都能發(fā)現(xiàn)6-氟-色滿的色滿結(jié)構(gòu)單元的存在。譬如，該結(jié)構(gòu)廣泛包含在維生素E及許多拮抗β受體的抗高血壓藥中。光學純的6-氟-色滿-2-羧酸用于新型降血壓藥物(S,R,R,R)-奈必洛爾的合成。(S,R,R,R)-奈必洛爾是第三代兼有血管擴張作用的心臟高度選擇性β1受體阻滯劑，主要用于治療原發(fā)性高血壓，能有效地控制高血壓和保持左心室功能，并且具有劑量低、副作用少，耐受性好等優(yōu)點。

6-氟-色滿-2-羧酸是制備奈必洛爾的關(guān)鍵中間體，其拆分效率決定制備奈必洛爾合成方法的最終結(jié)果。但是關(guān)于6-氟-色滿-2-羧酸(R)-，(S)-光學異構(gòu)體拆分方法文獻報道較少。迄今為止，化學方法、生物拆分法等是幾種拆分有機酸常用的辦法。文獻曾有報道使用脫氫樅胺拆分外消旋的6-氟-3,4-二氫-2H-1-苯并吡喃-2-甲酸，總拆分收率經(jīng)實驗證明約為32％。此化學拆分方法過程較冗長，并且脫氫樅胺手性拆分試劑價格較貴，效率不高。EP2646426報道過利用來源于真菌Ophiostoma novo-ulmi的酯酶拆分外消旋的6-氟-色滿-2-羧酸乙酯，分離純化得到(R)-6-氟-色滿-2-羧酸，ee值是90.72％，轉(zhuǎn)化率是50.28％。此類方法操作簡便，條件溫和。但是立體選擇性不高。

目前，市面上的方法主要是利用脂肪酶或酯酶拆分制備(R)-6-氟-色滿-2-羧酸，還沒有文獻關(guān)于利用脂肪酶或酯酶拆分制備(S)-6-氟-色滿-2-羧酸的報道，因此急需找到其他的高活性和高立體選擇性的脂肪酶/酯酶。基于此，本發(fā)明開發(fā)了S-酯酶拆分制備(S)-6-氟-色滿-2-羧酸的方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明以外消旋6-氟-色滿-2-羧酸甲酯為底物，利用離體的酯酶EstS或高效表達EstS的重組大腸桿菌的凍干菌體(fdcEstS)作為催化劑，選擇性催化(S)-6-氟-色滿-2-羧酸甲酯的水解反應(yīng)，由此制備獲得光學純的(S)-6-氟-色滿-2-羧酸，具有轉(zhuǎn)化率高、立體旋轉(zhuǎn)性強。因此本發(fā)明的第一個目的是提供一種表達酯酶EstS的大腸桿菌基因工程菌。本發(fā)明的第二個目的是提供一種表達酯酶EstS的大腸桿菌基因工程菌的應(yīng)用。本發(fā)明的第三個目的是提供一種微生物酶法拆分制備(S)-6-氟-色滿-2-羧酸的方法。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

作為本發(fā)明的第一個方面，一種表達酯酶EstS的大腸桿菌基因工程菌，其是將具有序列如SEQ ID NO.3所示的EstS基因序列的目的片段克隆到表達載體中，獲得重組質(zhì)粒，然后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞中制備獲得。

根據(jù)本發(fā)明，所述表達載體為pET-28a(+)表達載體。

作為本發(fā)明的第二個方面，一種表達酯酶EstS的大腸桿菌基因工程菌的制備方法，包括如下步驟：