[發明專利]一種表達酯酶EstS的大腸桿菌基因工程菌及其應用

在審

• 申請號: 202111589724.0
• 申請日: 2021-12-23
• 公開（公告）號: CN114214261A
• 公開（公告）日: 2022-03-22
• 發明（設計）人: 高蓓;魏東芝;王風清;江敏
• 申請（專利權）人: 華東理工大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/70;C12N15/55;C12P41/00;C12P17/06;C12R1/19
• 代理公司: 上海華工專利事務所(普通合伙) 31104
• 代理人: 繆利明;趙孟琴

1.一種表達酯酶EstS的大腸桿菌基因工程菌，其特征在于，其是將具有序列如SEQ IDNO.3所示的EstS基因序列的目的片段克隆到表達載體中，獲得重組質粒，然后將重組質粒轉化到大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞中制備獲得。

2.如權利要求1所述的表達酯酶EstS的大腸桿菌基因工程菌，其特征在于，所述表達載體為pET-28a(+)表達載體。

3.一種如權利要求1或2所述的表達酯酶EstS的大腸桿菌基因工程菌的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：

步驟一、提取熱鏈狀地芽孢桿菌Geobacillus thermocatenulatus strain BGSC 93A1的基因組DNA；

步驟二、以熱鏈狀地芽孢桿菌的EstS序列設計上下游引物，上游引物序列如SEQ IDNO.1所示，下游引物序列如SEQ ID NO.2所示；

步驟三、以步驟一的熱鏈狀地芽孢桿菌Geobacillus thermocatenulatus strainBGSC 93A1的基因組DNA為模板進行PCR擴增，得到目的DNA片段，序列如SEQ ID NO.3所示；

步驟四、將目的DNA片段克隆到pET-28a(+)表達載體，得重組質粒；

步驟五、將重組質粒轉化到大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞，獲得重組菌株。

4.一種含酯酶EstS基因的重組質粒，其特征在于，其是將具有序列如SEQ ID NO.3所示的EstS基因序列的目的片段克隆到表達載體中制備獲得。

5.一種酯酶EstS基因，其具有序列如SEQ ID NO.3所示的EstS基因序列。

6.一種如權利要求1或2所述的表達酯酶EstS的大腸桿菌基因工程菌在酶法拆分制備(S)-6-氟-色滿-2-羧酸的方法中的應用。

7.一種如權利要求1或2所述的表達酯酶EstS的大腸桿菌基因工程菌用作酶法拆分制備(S)-6-氟-色滿-2-羧酸的方法中的催化劑。

8.一種微生物酶法拆分制備(S)-6-氟-色滿-2-羧酸的方法，其特征在于，其是以權利要求1或2所述的表達酯酶EstS的大腸桿菌基因工程菌為催化劑，以外消旋6-氟-色滿-2-羧酸甲酯為底物，在pH為6.0-8.5的緩沖液中，加入有機溶劑，在20-60℃溫度下反應1-12小時，接著，進行分離純化。

9.如權利要求8所述的方法，其特征在于，所述的有機溶劑為異丙醇、丁醇、甲苯、正己烷、正庚烷或異辛烷中的一種。

10.如權利要求8所述的方法，其特征在于，所述的分離純化，其是在反應完成后，采用過濾方法去除表達酯酶EstS的大腸桿菌基因工程菌后，加入5M氫氧化鈉溶液調節pH至11-12后，分離有機相和水相，然后在水相中加入鹽酸溶液調節pH至1-2，用乙酸乙酯萃取3遍，旋蒸蒸發除去溶劑即可得到(S)-6-氟-色滿-2-羧酸白色固體。