[發明專利]基于噬菌體生物擴增結合實時熒光定量PCR快速檢測沙門氏菌的試劑盒及其方法

在審

• 申請號: 202111588265.4
• 申請日: 2021-12-23
• 公開（公告）號: CN114480679A
• 公開（公告）日: 2022-05-13
• 發明（設計）人: 王佳;邵彥春;李俊杰;丁一峰;黃晨曦;王小紅;張靜
• 申請（專利權）人: 華中農業大學
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6851;C12Q1/70;C12Q1/10;C12N15/11;C12R1/42;C12R1/92
• 代理公司: 武漢開元知識產權代理有限公司 42104
• 代理人: 馮超;劉琳

本發明公開了一種基于噬菌體生物擴增結合實時熒光定量PCR快速檢測沙門氏菌的試劑盒及其方法，所述試劑盒包括含有鼠傷寒沙門氏菌噬菌體T156的磷酸鹽緩沖液，以及實時熒光定量PCR(qPCR)檢測的引物對；噬菌體生物擴增聯合qPCR方法對食品基質中的沙門氏菌的最低檢出限為10CFU/mL，檢測時間僅為3.5h，且能區分活菌和死菌。本發明為快速檢測食品中沙門氏菌的污染提供了理論依據。

技術領域

本發明涉及食品安全檢測領域，具體涉及一種基于噬菌體生物擴增結合實時熒光定量PCR快速檢測沙門氏菌的試劑盒及其方法。

背景技術

沙門氏菌(Salmonella spp.)是引起食源性疾病的最常見的食源性致病菌之一，其感染人類造成的沙門氏菌病表現為嘔吐、腹瀉、發燒等癥狀，甚至導致死亡。研究表明，沙門氏菌主要通過食物感染人類，易污染肉、蛋、牛奶、水果、和蔬菜等食物。候海燕等人在2010-2016年間對江蘇省淮安市的262份生牛肉樣品進行沙門氏菌的檢測，其中24份樣品被檢測出沙門氏菌，檢出率高達9.16％。快速準確地檢測食品基質中的沙門氏菌是防止食品污染的有效措施，能夠顯著降低沙門氏菌感染人類的幾率。

傳統培養法以其靈敏度高、檢測結果準確、成本低等優勢，被公認為檢測病原菌的“金標準”，但是檢測過程復雜繁瑣且耗時，需要5-7d，難以滿足病原菌快速檢測的需求。基于噬菌體生物擴增的檢測方法以其特有的優勢用于病原微生物(包括沙門氏菌)檢測的研究。

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術的不足，提供了一種基于噬菌體生物擴增結合實時熒光定量PCR快速檢測沙門氏菌的試劑盒及其方法，該試劑盒利用鼠傷寒沙門氏菌噬菌體T156聯合檢測沙門氏菌，具有檢測時間短、速度快、靈敏度高、成本低、特異性強、可以區分死菌和活菌的特點。

為實現上述目的，本發明公開了一種基于噬菌體生物擴增結合實時熒光定量PCR快速檢測沙門氏菌的試劑盒，所述試劑盒包括含有沙門氏菌噬菌體T156的磷酸鹽緩沖液和實時熒光定量PCR檢測的引物對STp；

其中，沙門氏菌噬菌體T156已送至中國典型培養物保藏中心保藏，分類命名：鼠傷寒沙門氏菌噬菌體(Salmonella Typhimurium bacteriophage)T156，于2020年7月6日將該噬菌體T156保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏地址為湖北省武漢市武漢大學，保藏編號為：CCTCC NO：M2020288。其中，該鼠傷寒沙門氏菌噬菌體在申請號為202010712852.9、發明名稱為鼠傷寒沙門氏菌噬菌體T156及其應用的中國發明專利公開；

其中，所述引物對STp為：

正向引物STp-F：5′-CACTCAGCCGCACTATCAAT-3′，

反向引物STp-R：5′-TCATCGCACTAACCGTAAGC-3′；

進一步地，所述試劑盒還包括氯化鈣溶液、陰性對照品、陽性對照品；其中，

氯化鈣溶液的使用濃度為20mmol/L，

陰性對照品為PBS緩沖液，PBS緩沖液摩爾濃度為0.05mol/L，

陽性對照品為鼠傷寒沙門氏菌ATCC13311。

本發明提供了一種利用上述試劑盒檢測沙門氏菌的方法，包括以下步驟：

1)噬菌體生物擴增法檢測

a.將沙門氏菌噬菌體T156懸液與待檢測的樣品混合，再加入氯化鈣溶液，加入LB培養基補至1mL，得到培養物A；

b.將上述培養物置于37℃恒溫搖床培養60min，得到培養物B；

2)噬菌體的實時熒光定量PCR檢測：