[發明專利]基于噬菌體生物擴增結合實時熒光定量PCR快速檢測沙門氏菌的試劑盒及其方法在審
| 申請號： | 202111588265.4 | 申請日： | 2021-12-23 |
| 公開（公告）號： | CN114480679A | 公開（公告）日： | 2022-05-13 |
| 發明（設計）人： | 王佳;邵彥春;李俊杰;丁一峰;黃晨曦;王小紅;張靜 | 申請（專利權）人： | 華中農業大學 |
| 主分類號： | C12Q1/689 | 分類號： | C12Q1/689;C12Q1/6851;C12Q1/70;C12Q1/10;C12N15/11;C12R1/42;C12R1/92 |
| 代理公司： | 武漢開元知識產權代理有限公司 42104 | 代理人： | 馮超;劉琳 |
| 地址： | 430070 湖*** | 國省代碼： | 湖北;42 |
| 權利要求書： | 查看更多 | 說明書： | 查看更多 |
| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 基于 噬菌體 生物 擴增 結合 實時 熒光 定量 pcr 快速 檢測 沙門氏菌 試劑盒 及其 方法 | ||
1.一種基于噬菌體生物擴增結合實時熒光定量PCR快速檢測沙門氏菌的試劑盒，其特征在于：所述試劑盒包括含有沙門氏菌噬菌體T156的磷酸鹽緩沖液和實時熒光定量PCR檢測的引物對STp：
正向引物STp-F：5′-CACTCAGCCGCACTATCAAT-3′，
反向引物STp-R：5′-TCATCGCACTAACCGTAAGC-3′。
2.根據權利要求1所述快速檢測沙門氏菌的試劑盒，其特征在于：所述試劑盒還包括氯化鈣溶液、陰性對照品、陽性對照品；其中，
氯化鈣溶液的使用濃度為20mmol/L，
陰性對照品為PBS緩沖液，PBS緩沖液摩爾濃度為0.05mol/L，
陽性對照品為鼠傷寒沙門氏菌ATCC 13311。
3.一種利用權利要求1所述試劑盒檢測沙門氏菌的方法，其特征在于：包括以下步驟：
1)噬菌體生物擴增法檢測
a.將沙門氏菌噬菌體T156懸液與待檢測的樣品混合，再加入氯化鈣溶液，加入LB培養基補至1mL，得到培養物A；
b.將上述培養物A置于37℃恒溫搖床培養60min，得到培養物B；
2)噬菌體的實時熒光定量PCR檢測：
a.分別取上述培養物A和培養物B提取噬菌體DNA，并保存于-20℃；
b.以噬菌體的DNA為模板，利用引物對STp進行實時熒光定量PCR得到PCR產物，其中，引物對STp為：
正向引物STp-F：5′-CACTCAGCCGCACTATCAAT-3′，
反向引物STp-R：5′-TCATCGCACTAACCGTAAGC-3′；
c.根據兩個PCR產物的Ct值的差值ΔCt定性判斷樣品中是否存在有活性的鼠傷寒沙門氏菌，判斷依據為：
當ΔCt≥1時，認定為檢測出沙門氏菌；
d.以菌液濃度為橫坐標，ΔCt為縱坐標，制作標準曲線，定量分析食品樣品中鼠傷寒沙門氏菌的濃度。
4.根據權利要求3所述檢測沙門氏菌的方法，其特征在于：所述步驟1)第a小步中，沙門氏菌噬菌體T156懸液與前處理樣品按體積1:1混合，再加入同等體積的氯化鈣溶液，其工作濃度為20mmol/L，且沙門氏菌噬菌體T156懸液的濃度為105PFU/mL。
5.根據權利要求3所述檢測沙門氏菌的方法，其特征在于：所述步驟1)第b小步中，培養物A置于37℃恒溫搖床中振蕩培養，培養時間為60min。
6.根據權利要求3所述檢測沙門氏菌的方法，其特征在于：所述步驟2)中第a小步中，將培養物A和培養物B用熱裂解的方式提取DNA作為模板，即提取噬菌體與宿主菌混合培養前后樣品中的DNA作為模板。
7.根據權利要求3所述檢測沙門氏菌的方法，其特征在于：所述步驟2)中第b小步中，PCR的反應體系如下：
該專利技術資料僅供研究查看技術是否侵權等信息，商用須獲得專利權人授權。該專利全部權利屬于華中農業大學，未經華中農業大學許可，擅自商用是侵權行為。如果您想購買此專利、獲得商業授權和技術合作，請聯系【客服】
本文鏈接：http://www.szxzyx.cn/pat/books/202111588265.4/1.html，轉載請聲明來源鉆瓜專利網。
