[發明專利]一種生產FecB基因g.A746G定點突變綿羊的試劑盒及其方法

在審

• 申請號: 202111586529.2
• 申請日: 2021-12-21
• 公開（公告）號: CN114262708A
• 公開（公告）日: 2022-04-01
• 發明（設計）人: 王小龍;周世衛;陳玉林;高亞偉;王倩;蔡蓓
• 申請（專利權）人: 西北農林科技大學
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C12N15/10;C12N15/63;C12N15/66;C12N15/89;C12N15/113;C12N5/10;C12Q1/6888;C12N15/11
• 代理公司: 北京科領智誠知識產權代理事務所(普通合伙) 11782
• 代理人: 陳士騫

本發明公開了一種生產FecB基因g.A746G定點突變綿羊的試劑盒及其方法。所述的試劑盒中含有FecB?pegRNA的體外轉錄模板質粒、FecB?sgRNA的體外轉錄模板質粒以及PE2mRNA的體外轉錄模板質粒，以FecB?pegRNA的體外轉錄模板質粒、FecB?sgRNA的體外轉錄模板質粒為模板經PCR擴增得到的FecB?pegRNA體外轉錄模板序列如SEQ ID No.4所示，FecB?sgRNA體外轉錄模板序列如SEQ ID No.5所示。將體外轉錄獲得的pegRNA、sgRNA及PE2mRNA純化后混合，注射入綿羊受精卵細胞質中，受精卵體外培養后移植入同種雌性綿羊輸卵管中，生產的后代經檢測后獲得FecB基因g.A746G定點突變綿羊。本發明模擬自然界中存在的FecB基因g.A746G綿羊，同時與傳統CRISPR/Cas技術相比極大地避免了隨機突變、bystander突變、脫靶突變及基因組損傷，因此安全性更高。本發明為綿羊的精確基因編輯提供了重要技術支撐。

技術領域

本發明涉及一種生產FecB基因g.A746G定點突變綿羊的試劑盒及其方法，特別地，涉及一種利用新型基因編輯系統Prime Editing生產FecB基因g.A746G定點突變綿羊的試劑盒及其方法。屬于動物基因工程和遺傳修飾技術領域。

背景技術

CRISPR/Cas系統是在細菌和古細菌中發現的一種獲得性免疫系統，能特異性地靶向并切割噬菌體DNA以抵御入侵。經人工改造后的CRISPR/Cas9技術借助sgRNA與基因組DNA序列的特異性識別與結合作用，能夠實現對靶基因的定點切割，在生物學相關領域應用廣泛，涉及到生物、醫學和農業等。

單核苷酸多態性(SNP)是哺乳動物中最常見的遺傳變異類型。據報道，大量單堿基突變與人類疾病及生產性狀相關。單堿基編輯技術是目前常用的基因組定點突變方法，其能夠實現A→G與C→T的點突變，但不能實現4種堿基的任意變換，同時在全基因組范圍內存在著一定的脫靶效應。最近報道的一種新的基因編輯技術Prime Editing(PE)不僅保持了精準編輯，還大幅度減少了脫靶效應，同時能夠實現4種堿基的任意變換。該技術是在dCas9蛋白上融合了一個反轉錄原件，同時在sgRNA的基礎上又加入了兩段新的序列——引物結合序列(Primer binding site，PBS)以及轉錄模板序列(RT template including edit，RT)。其基本工作原理如下：原有的sgRNA序列仍結合PAM序列后的約20個堿基，打開DNA雙鏈，引導改造后的dCas9蛋白。PBS序列則在解螺旋的另一條單鏈上與設計位點結合，起到一個類似PCR過程中引物結合DNA單鏈后引導后續鏈合成的作用，引導后續的RT序列在反轉錄原件作用下的反轉錄過程，一般情況下，靶向編輯位點的編輯信息包含在RT序列中。

FecB基因是最早發現的控制綿羊高繁殖力的主效基因，對排卵數的影響呈加性效應，對產羔數的影響呈部分顯性效應。一個FecB拷貝可增加1.3～1.6枚排卵數，0.9～1.2只產羔數，兩個FecB拷貝可增加2.7～3.0枚排卵數，1.1～1.7只產羔數。研究表明，FecB基因的定點突變(g.A746G，p.Q249R)致使其高度保守區域中的谷氨酰胺突變為精氨酸，喪失部分生物學活性，降低其配體BMP4和GDF5對類固醇生成的抑制作用，加速顆粒細胞分化，促進卵泡發育及排卵，提高動物的繁殖性能。

發明內容

本發明的目的之一是提供一種生產FecB基因g.A746G定點突變綿羊的試劑盒。

本發明的目的之二是提供一種利用所述的試劑盒生產FecB基因g.A746G定點突變綿羊的方法。

為了達到上述目的，本發明采用了以下技術手段：