[發明專利]一種生產FecB基因g.A746G定點突變綿羊的試劑盒及其方法

在審

• 申請號: 202111586529.2
• 申請日: 2021-12-21
• 公開（公告）號: CN114262708A
• 公開（公告）日: 2022-04-01
• 發明（設計）人: 王小龍;周世衛;陳玉林;高亞偉;王倩;蔡蓓
• 申請（專利權）人: 西北農林科技大學
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C12N15/10;C12N15/63;C12N15/66;C12N15/89;C12N15/113;C12N5/10;C12Q1/6888;C12N15/11
• 代理公司: 北京科領智誠知識產權代理事務所(普通合伙) 11782
• 代理人: 陳士騫

1.一種生產FecB基因g.A746G定點突變綿羊的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒中含有FecB-pegRNA的體外轉錄模板質粒、FecB-sgRNA的體外轉錄模板質粒以及PE2 mRNA的體外轉錄模板質粒，以FecB-pegRNA的體外轉錄模板質粒、FecB-sgRNA的體外轉錄模板質粒為模板通過PCR擴增得到的FecB-pegRNA體外轉錄模板序列如SEQ ID No.4所示，FecB-sgRNA體外轉錄模板序列如SEQ ID No.5所示。

2.如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述的FecB-pegRNA的體外轉錄模板質粒是通過以下方法構建得到：

(1)合成靶向FecB基因序第746位堿基的Space、Scaffold、RT-PBS的寡核苷酸序列：

(2)將Space、Scaffold、RT-PBS寡核苷酸鏈進行退火，分別得到Space退火產物、Scaffold退火產物以及RT-PBS退火產物；

(3)以pGL3-U6-sgRNA-PGK-puromycin質粒為模板，使用以下引物進PCR擴增，得到構建體外轉錄模板質粒的骨架：

F1：AGCTAGGTCTCCTTTTTTTAAAGAATTCTCGACCTCGAGAC

R1：TCTCTCGGTCTCACGGTGTTTCGT

(4)將體外轉錄模板質粒骨架進行純化回收，回收產物使用BsaI限制性內切酶酶切后進行純化回收，與Space退火產物、Scaffold退火產物、RT-PBS退火產物連接；

(5)將連接產物轉化至DH5α感受態細胞，將測序結果正確的菌液擴大培養并提取質粒，得到的質粒為FecB-pegRNA體外轉錄模板質粒；

所述的FecB-sgRNA的體外轉錄模板質粒是通過以下方法構建得到：

(1)合成位于Space附近sgRNA的寡核苷酸序列：

sgRNA-Up：accgTTCTGTCTCTCGGAACCAGC

sgRNA-Down：aaacGCTGGTTCCGAGAGACAGAA

(2)將sgRNA寡核苷酸鏈退火，得到sgRNA退火產物；

(3)將pGL3-U6-sgRNA-PGK-puromycin使用BsaI限制性內切酶進行線性化，純化回收線性化的pGL3-U6-sgRNA-PGK-puromycin，并將其與sgRNA退火產物連接；

(5)將連接產物轉化至DH5α感受態細胞，將測序結果正確的菌液擴大培養并提取質粒，即FecB-sgRNA體外轉錄模板質粒；

所述的PE2 mRNA的體外轉錄模板質粒為pCMV-PE2質粒。

3.如權利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒還包括用于通過PCR擴增得到FecB-pegRNA體外轉錄模板序列的引物F2/R2以及用于通過PCR擴增得到FecB-sgRNA體外轉錄模板序列的引物F3/R3，所述的引物序列如下：

F2：gatccctaatacgactcactataggTCACTACAGAGGAGGCCAGC

R2：AAAAAAAATACAGAGGAGGCCAGCTGGT

F3：atccctaatacgactcactataggTTCTGTCTCTCGGAACCAGC

R3：AAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTC。

4.如權利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒還包括用于檢測FecB基因g.A746G定點突變綿羊的PCR引物，若PCR擴增產物的第163位堿基為G，則羔羊為FecB基因g.A746G定點突變綿羊；

正向引物F：5’-AGGTCCAGAGGACGATAGCA-3’；

反向引物R：5’-AGGAAACCCTGAACATCGCTAA-3’。

5.權利要求1-4任一項所述的試劑盒在制備利用基因編輯系統Prime Editing生產FecB基因g.A746G定點突變綿羊的受精卵中的用途。