[發明專利]產二氫尼洛替星的重組釀酒酵母及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 202111576150.3
• 申請日: 2021-12-22
• 公開（公告）號: CN113956990B
• 公開（公告）日: 2022-06-03
• 發明（設計）人: 薛強;王彩霞;侯康鑫;蘇新尭;劉佳;于宛彤
• 申請（專利權）人: 中國中醫科學院中藥研究所
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N15/53;C12N15/54;C12N15/60;C12N15/61;C12P17/18;C12R1/865
• 代理公司: 北京華進京聯知識產權代理有限公司 11606
• 代理人: 彭輝

1.一種二氫尼洛替星的制備方法，其特征在于，所述制備方法包括以重組釀酒酵母為工程菌進行發酵的步驟；

所述重組釀酒酵母的保藏編號為CGMCC No. 23630；

發酵采用的條件包括：28℃～32℃，pH5.0～5.5，轉速100～800rpm，溶氧＞30%，發酵時溶氧與轉速關聯，自動補糖與溶氧負反饋關聯；種子液接種至裝有含葡萄糖的YPD培養基的發酵罐中，當葡萄糖含量為0時開始用半乳糖補料，每隔12h取樣，發酵144h。

2.根據權利要求1所述的二氫尼洛替星的制備方法，其特征在于，所述重組釀酒酵母的制備方法包括：敲除釀酒酵母中的BTS1基因和ERG27基因，過表達所述釀酒酵母的ERG19基因、ERG10基因、ERG12基因和IDI1基因，并在所述酵母菌中外源表達AtCPR基因、AiOSC1基因、tHMGR基因、AtSQE2基因和AiCYP71CD2基因。

3.根據權利要求2所述的二氫尼洛替星的制備方法，其特征在于，所述制備方法包括：

敲除釀酒酵母中的BTS1基因和ERG27基因，制備釀酒酵母C-E-B；

在所述釀酒酵母C-E-B的染色體rDNA位點整合ERG19基因、ERG10基因、ERG12基因、IDI1基因和AtCPR基因，制備釀酒酵母CB-9；

在所述釀酒酵母CB-9的染色體Delta位點上整合AiCYP71CD2基因、AiOSC1基因、tHMGR基因和AtSQE2基因，制備釀酒酵母DI-3，獲得重組釀酒酵母；

所述AiCYP71CD2基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

4.根據權利要求3所述的二氫尼洛替星的制備方法，其特征在于，獲取所述AiCYP71CD2基因的步驟包括：以印楝的cDNA為模板，以核苷酸序列如SEQ ID No.39和SEQ ID No.40所示的擴增引物進行擴增，獲得所述AiCYP71CD2基因。

5.根據權利要求3或者4所述的二氫尼洛替星的制備方法，其特征在于，在染色體rDNA位點上整合的同源重組片段依次包含IDI1基因、ERG19基因、ERG10基因、ERG12基因和AtCPR基因。

6.根據權利要求3或者4所述的二氫尼洛替星的制備方法，其特征在于，所述AiCYP71CD2基因在所述Delta位點上連接于所述AiOSC1基因和所述tHMGR基因之間。

7.根據權利要求3或者4所述的二氫尼洛替星的制備方法，其特征在于，整合采用醋酸鋰轉化法。

8.根據權利要求2至4任一項所述的二氫尼洛替星的制備方法，其特征在于，所述制備方法還包括從所述重組釀酒酵母中挑選出二氫尼洛替星產量高的重組釀酒酵母的步驟。