[發明專利]產二氫尼洛替星的重組釀酒酵母及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 202111576150.3
• 申請日: 2021-12-22
• 公開（公告）號: CN113956990B
• 公開（公告）日: 2022-06-03
• 發明（設計）人: 薛強;王彩霞;侯康鑫;蘇新尭;劉佳;于宛彤
• 申請（專利權）人: 中國中醫科學院中藥研究所
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N15/53;C12N15/54;C12N15/60;C12N15/61;C12P17/18;C12R1/865
• 代理公司: 北京華進京聯知識產權代理有限公司 11606
• 代理人: 彭輝

本發明涉及一種重組釀酒酵母及其制備方法與應用。本發明提供的重組釀酒酵母，其保藏編號為CGMCC No.23630。與傳統技術相比，本發明具備如下有益效果：本發明提供的重組釀酒酵母能產二氫尼洛替星，為實現二氫尼洛替星的生物合成提供了工程菌，為釀酒酵母工業化生產二氫尼洛替星化合物提供新的途徑，還可以將其作為底盤菌株在胞內鑒定印楝生物下游合成途徑中的功能基因。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，涉及利用合成生物學生產三萜化合物等技術領域，具體地，本發明涉及產二氫尼洛替星的重組釀酒酵母的制備方法及其應用。

背景技術

印楝素是一種公認無害的植物源殺蟲劑，是從楝屬植物印楝種子中提取的一種高度氧化的檸檬苦素類三萜化合物，有10多種類似物，但大家通常所說的印楝素指的是印楝素A，相對分子質量為720.71。印楝素純品為白色非結晶物質，易溶于甲醇、丙酮和二甲亞砜等極性有機溶劑，對光、熱都不穩定。印楝素對200多種害蟲有明顯的驅避效果，使用更加安全、對環境的壓力小，是目前全球公認的最優秀的生物農藥。

印楝素及其前體物質二氫尼洛替星均具有殺蟲功效，但是兩者在植物中的含量很低，僅存在于印楝樹的樹葉樹皮及種子中，其中種仁中印楝素的含量最高，但也僅有0.02%。印楝素的含量還取決于印楝的品種以及種子的收獲時間，隨著種子的成熟，印楝素的含量會呈現先增加再下降的趨勢。另外，印楝素的含量與種植的氣候條件有關，雨水溫度濕度均會影響印楝素的含量，印楝生長8年到盛果期株產帶內果皮的種子有30kg-50kg。由于印楝是唯一的印楝素生物制品加工的原材料，且喜熱，只適宜在熱帶亞熱帶的干旱地區生長，通過自然界提取大量印楝素大規模商用較為困難，因此通過化學合成和生物合成的手段來獲取印楝素及其前體二氫尼洛替星成為研究熱點。

科學家們最初在1987年開始研究印楝素的化學合成，因其復雜的結構，花費22年實現了印楝素的全合成，但該合成步驟多達71步，收率僅有0.00015%。化學合成成本高，收率低，限制了其工業化生產。因此科學家們將目光轉向了生物合成，通過微生物發酵藥用植物活性成分具有成本低，環境友好且不受時空限制等優勢，因此學者們很關注通過微生物來生產藥用植物次生代謝產物。Yan等成功從人參中克隆出一個催化原人參二醇生成人參皂苷CK的糖基轉移酶基因UGTPg1，然后通過將人參皂苷CK合成途徑的基因引入釀酒酵母，獲得了可以生產人參皂苷CK的釀酒酵母菌株。但印楝素等檸檬苦素類化合物的生物合成途徑幾乎是空白的，想在微生物中組裝其合成途徑是一個非常巨大的挑戰。

發明內容

基于以上技術問題，本發明的目的之一是提供一株重組釀酒酵母，該釀酒酵母能產二氫尼洛替星，為實現二氫尼洛替星的生物合成提供了工程菌。

本發明的目的可以通過以下技術方案實現：

一株重組釀酒酵母，其保藏編號為CGMCC No.23630。

一種重組釀酒酵母的制備方法，所述制備方法包括：敲除釀酒酵母中的BTS1基因和ERG27基因，過表達所述釀酒酵母的ERG19基因、ERG10基因、ERG12基因和IDI1基因，并在所述酵母菌中外源表達AtCPR基因、AiOSC1基因、tHMGR基因、AtSQE2基因和AiCYP71CD2基因。

在其中一些實施例中，所述制備方法包括：

敲除釀酒酵母中的BTS1基因和ERG27基因，制備釀酒酵母C-E-B；

在所述釀酒酵母C-E-B的染色體rDNA位點整合ERG19基因、ERG10基因、ERG12基因、IDI1基因和AtCPR基因，制備釀酒酵母CB-9；

在所述釀酒酵母CB-9的染色體Delta位點上整合AiCYP71CD2基因、AiOSC1基因、tHMGR基因和AtSQE2基因，制備釀酒酵母DI-3，獲得重組釀酒酵母；

所述AiCYP71CD2基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。