[發明專利]一種L-肌肽、L-組氨酸、β-丙氨酸甲酯鹽酸鹽含量的快速測定方法

在審

• 申請號: 202111573075.5
• 申請日: 2021-12-21
• 公開（公告）號: CN116298039A
• 公開（公告）日: 2023-06-23
• 發明（設計）人: 喬莉蘋;周寧;于魯孟;羅月;馬欣娟;郭學平
• 申請（專利權）人: 華熙生物科技股份有限公司;華熙生物科技（天津）有限公司
• 主分類號: G01N30/88
• 分類號: G01N30/88
• 代理公司: 北京唐頌永信知識產權代理有限公司 11755
• 代理人: 劉偉

本發明提供了一種檢測L?肌肽中的L?組氨酸和β?丙氨酸甲酯鹽酸鹽的含量的方法，包括配制待測樣品和標準品；使用高效液相色譜法，以無機和有機溶液的混合液為流動相，使用外標法來計算所述待測樣品中L?肌肽以及L?組氨酸和β?丙氨酸甲酯鹽酸鹽的含量。本發明的所述的檢測方法操作簡單、分析時間短、分離度高，能同時快速檢測L?肌肽、L?組氨酸和β?丙氨酸甲酯鹽酸鹽的含量。

技術領域

本發明涉及檢測領域，具體涉及一種L-肌肽生產過程中L-肌肽、L-組氨酸和β-丙氨酸甲酯鹽酸鹽含量的快速檢測方法。

背景技術

L-肌肽廣泛存在于機體組織的細胞內，在肌肉和中樞神經系統表達最高，在脊椎動物骨骼中，L-肌肽的含量約為1.6～20.6μmol/g，在豬肉、牛肉和雞肉中的含量分別為4.8、2.0和15.0mmol，在人體肌肉中的含量為2～20mmol。隨著對L-肌肽研究深入，學者們紛紛研究了L-肌肽的生物學特性。迄今為止，L-肌肽的許多生物學活性已被證實，如生理pH緩沖作用、螯合金屬離子、清除自由基、抗氧化、防止蛋白質糖化、抗衰老、抗炎以及抗腫瘤等。

以L-組氨酸和β-丙氨酸甲酯鹽酸鹽為底物，可酶法制備L-肌肽，在生產過程中，若底物轉化不完全、純化不徹底，將存在生產成本增加、L-肌肽成品中殘留L-組氨酸和β-丙氨酸甲酯鹽酸鹽的風險，因此建立一種快速高效的分析方法有利于控制生產過程和成品雜質。

L-肌肽的檢測尚無國家標準，且未見L-肌肽生產過程中L-肌肽、L-組氨酸和β-丙氨酸甲酯鹽酸鹽的快速檢測方法報道。

文獻CN202010513278.4中公開了一種L-肌肽和L-組氨酸的分離方法，其L-肌肽檢測的色譜條件為：采用C18色譜柱，以癸烷磺酸鈉緩沖溶液(取癸烷磺酸鈉1.22g、磷酸氫二鉀11.41g溶于1000mL去離子水中，并以磷酸溶液調節PH至3.0即得)：乙腈＝78：22(v/v)進行洗脫，流速為1.0mL/min，檢測器為紫外檢測器，波長為215nm。該方法的檢測流動相配制繁瑣，且癸烷磺酸鈉有一定的毒性，對實驗人員及環境具有一定的危害。

宋揚等公開了一種“HPLC法測定大鼠腦組織游離天門冬氨酸、谷氨酸、L-肌肽及γ-氨基丁酸”的方法，其采用C18色譜柱，以乙腈和磷酸鹽緩沖液為流動相，用鄰苯二甲醛為柱前衍生劑，在熒光檢測器下，采用二元梯度洗脫檢測，檢測時間長達45min以上，該方法樣品檢測時間較長，且使用梯度洗脫，過程較繁瑣，不利于L-肌肽生產過程中的物質快速的檢測。

發明內容

為了解決上述問題，本發明提供了一種高效液相分析方法，可快速檢測L-肌肽生產過程中L-肌肽、L-組氨酸和β-丙氨酸甲酯鹽酸鹽的含量，方法操作簡便，分析時間短、分離度高。

具體的，本發明采用的技術方案是：

一種測定包含L-組氨酸和β-丙氨酸甲酯鹽酸鹽的L-肌肽中L-肌肽含量的方法，其包括：

配制待測樣品和標準品，使用衍生化試劑進行柱前衍生化；

使用高效液相色譜法，以無機和有機溶液的混合液為流動相，使用外標法來計算所述待測樣品中L-肌肽以及L-組氨酸和β-丙氨酸甲酯鹽酸鹽的含量。

根據項1任一項所述的方法，其中，所述無機和有機溶液的混合液為乙酸鈉溶液和乙腈的混合溶液，優選，所述乙酸鈉溶液和乙腈按體積比混合的比例為75-65：25-35，優選為75-70：25-30。

根據項2所述的方法，其中，所述乙酸鈉溶液的濃度為45-100mmol/L，優選為45-55mmol/L。

根據項2或3所述的方法，其中，所述乙酸鈉溶液的pH值為4.0-5.5，優選為4.5-5.0。

根據項1-4中任一項所述的方法，其中，所述流動相的流速為0.6-1.0mL/min，優選為0.8-1.0mL/min。