[發(fā)明專(zhuān)利]一種核桃青皮多酚提取物降脂的潛在標(biāo)志物及代謝通路的獲得方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202111572448.7
• 申請(qǐng)日: 2021-12-21
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN114428130A
• 公開(kāi)（公告）日: 2022-05-03
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 趙聲蘭;王小雙;陳丹;馬雅鴿;張希;趙慶宇婧;林玉萍
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 云南中醫(yī)藥大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): G01N30/02
• 分類(lèi)號(hào): G01N30/02;G01N30/06;G01N30/86
• 代理公司: 昆明知道專(zhuān)利事務(wù)所(特殊普通合伙企業(yè)) 53116
• 代理人: 姜開(kāi)俠

1.一種核桃青皮多酚提取物降脂的肝臟潛在代謝標(biāo)志物，其特征在于所述標(biāo)志物被核桃青皮多酚提取物顯著影響的從肝臟代謝物中篩選到18種潛在標(biāo)志物，其中正離子模式下13種，負(fù)離子模式下5種，包括核黃素、pipecolic酸、酪氨酸、L-methionine、賴(lài)氨酸、L-leucine、次黃嘌呤、Glycerophosphocholine、谷胱甘肽、Gamma-Glu-Leu、胞嘧啶核苷、9 h-xanthine、R肉堿、UDP-glucose、眼酸、N-Acetylglutamic酸、葡萄糖6-phosphate、ADP；

所述標(biāo)志物從高脂飲食誘導(dǎo)的高脂血癥大鼠及核桃青皮多酚提取物干預(yù)后的肝臟代謝產(chǎn)物中獲得代謝指紋圖譜，利用多元變量統(tǒng)計(jì)分析篩選出18個(gè)核桃青皮多酚提取物的潛在降脂標(biāo)志物并進(jìn)行鑒定；

通過(guò)MetPA分析兩組差異代謝物的相關(guān)代謝通路，得到12條被核桃青皮多酚提取物干預(yù)后肝臟代謝通路，分別為D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代謝，苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成，谷胱甘肽代謝，?；撬岷痛闻；撬岽x，纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的生物合成，戊糖和葡萄糖酸鹽相互轉(zhuǎn)化，丙氨酸、天門(mén)冬氨酸和谷氨酸代謝，煙酸和煙酰胺代謝，精氨酸和脯氨酸代謝，色氨酸代謝，酪氨酸代謝，淀粉和蔗糖代謝。

2.一種獲得權(quán)利要求1核桃青皮多酚提取物降脂的潛在標(biāo)志物及代謝通路的方法，其特征在于所述方法由下列具體操作步驟實(shí)現(xiàn)：

（1）核桃青皮多酚提取物的制備

將核桃青皮曬干粉碎過(guò)80目篩，稱(chēng)取一定量核桃青皮粉末以液料比20:1加入50~70％乙醇回流提取80~100min，溫度控制為50~60℃，提取2次，合并濾液，真空濃縮，冷凍干燥得到核桃青皮多酚提取物；

（2）高脂飼料制備

高脂飼料由重量份的基礎(chǔ)飼料60~75份、蛋黃粉5~15份、豬油5~15份、膽固醇1~4份、豬膽鹽0.6~1.0份、蔗糖5~15份、食鹽0.1~0.3份，混勻，制備成型后于45~55℃烘干；

（3）動(dòng)物模型的制備

健康雄性SD大鼠72只，體重130~150g，適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，將大鼠隨機(jī)分為2組：一組為模型組60只，另一組為正常對(duì)照組12只；正常對(duì)照組大鼠給予普通飼料喂養(yǎng)，模型組大鼠給予自制高脂飼料喂養(yǎng)，用以構(gòu)建高脂血癥大鼠模型；造模4周，隨機(jī)抽取模型組和對(duì)照組大鼠各6只，采集血液，檢測(cè)血液中的總膽固醇TC和甘油三酯TG，評(píng)判高脂血癥大鼠模型造模是否成功，取造模成功的高脂血癥大鼠，隨機(jī)分為模型組，陽(yáng)性藥組和核桃青皮多酚提取物干預(yù)組；

（4）大鼠肝臟的采集和前處理

試驗(yàn)?zāi)┢?，大鼠禁食不禁?2h，用10%水合氯醛麻醉后解剖大鼠，迅速取出肝臟，用0.9%的生理鹽水漂洗，去除血漬和污物，并剔除結(jié)締組織和脂肪組織等，吸干，用無(wú)菌剪刀將樣品分割成1g左右的小塊，分裝于無(wú)菌離心管，立即置液氮中速凍至少15min后置-80℃保存；取肝臟樣品得到待測(cè)樣本，利用UPLC/Q-TOF-MS技術(shù)檢測(cè)肝臟代謝產(chǎn)物；

（5）LC-MS檢測(cè)

色譜條件：儀器采用WatersACQUITYUPLC，使用ACQUITYUPLC?BEH C18 1.7μm（2.1×100mm）色譜柱，自動(dòng)進(jìn)樣器溫度4℃，以0.25mL/min的流速，40℃的柱溫，進(jìn)樣10μL進(jìn)行梯度洗脫，流動(dòng)相為A相0.1%甲酸水和B相0.1%甲酸乙腈；梯度洗脫程序?yàn)?~1min，2%B相；1~9.5min，2~50%B相；9.5~14min，50~98%B相；14~15min，98%B相；15~15.5min，98~2%B相；15.5~17min，2% B相；質(zhì)譜條件：儀器使用ThermoLTQOrbitrapXL電噴霧離子源ESI，正負(fù)離子電離模式，正離子噴霧電壓為4.80kV，負(fù)離子噴霧電壓為4.50kV，鞘氣45arb，輔助氣15arb；毛細(xì)管溫度325℃，毛細(xì)管電壓35V/-15V，管透鏡電壓50V/-50V，以分辨率60000進(jìn)行全掃描，掃描范圍50~1000，并采用CID進(jìn)行二級(jí)裂解，碰撞電壓為30eV，同時(shí)采用動(dòng)態(tài)排除（重復(fù)計(jì)數(shù)為2）去除無(wú)必要的MS/MS信息，動(dòng)態(tài)排除時(shí)間設(shè)置為15s；

（6）數(shù)據(jù)預(yù)處理

通過(guò)Proteowizard軟件將獲得的原始數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成mzXML格式，利用R的XCMS程序包進(jìn)行峰識(shí)別、峰過(guò)濾、峰對(duì)齊；主要參數(shù)有bw=5，ppm=15，peakwidth=c（10,120），mzwid=0.015，mzdiff=0.01，method=centWave，得到包括質(zhì)核比m/z和保留時(shí)間及峰面積等信息的數(shù)據(jù)矩陣；正離子模式獲得4535個(gè)前體分子，負(fù)離子模式獲得4188個(gè)前體分子，導(dǎo)出數(shù)據(jù)至excel進(jìn)行后續(xù)分析；為使不同量級(jí)的數(shù)據(jù)能夠進(jìn)行比較，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行峰面積的批次歸一化；

（7）潛在生物標(biāo)志物的篩選及通路分析

首先對(duì)樣品數(shù)據(jù)采用自適換算（UV），然后進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析。