[發(fā)明專利]制備L-纈氨酸的方法及其所用生物材料

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202111563021.0
• 申請(qǐng)日: 2021-12-20
• 公開（公告）號(hào): CN114277069A
• 公開（公告）日: 2022-04-05
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 趙春光;孟剛;魏愛英;田斌;畢國東;賈慧萍
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 寧夏伊品生物科技股份有限公司
• 主分類號(hào): C12P13/08
• 分類號(hào): C12P13/08;C07K14/34;C12N15/31;C12N1/21;C12N15/77;C12R1/15
• 代理公司: 北京紀(jì)凱知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11245
• 代理人: 關(guān)暢

本發(fā)明公開了制備L?纈氨酸的方法及其所用生物材料。具體地公開了突變蛋白質(zhì)CEY17_RS13420^G239E及其編碼基因。本發(fā)明構(gòu)建了包含點(diǎn)突變(G?A)的基因工程菌，以及過表達(dá)CEY17_RS13420基因或CEY17_RS13420^G716A基因的工程菌。實(shí)驗(yàn)表明，CEY17_RS13420基因及其變體參與了L?纈氨酸的生物合成，對(duì)CEY17_RS13420基因編碼區(qū)進(jìn)行點(diǎn)突變或在生產(chǎn)菌中過表達(dá)CEY17_RS13420基因和/或其突變體，有助于L?纈氨酸產(chǎn)量及轉(zhuǎn)化率的提高，可以培育符合工業(yè)化生產(chǎn)的高產(chǎn)高質(zhì)量菌種，對(duì)L?纈氨酸的工業(yè)化生產(chǎn)具有重要的意義。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及制備L-纈氨酸的方法及其所用生物材料。

背景技術(shù)

L-纈氨酸化學(xué)名稱為α-氨基異戊酸，是支鏈氨基酸之一，人和動(dòng)物自身不能合成。L-纈氨酸是人體八種必需氨基酸之一，具有促進(jìn)蛋白合成、抑制蛋白分解的作用，增強(qiáng)機(jī)體的免疫防護(hù)作用，有助于糾正因手術(shù)、創(chuàng)傷、感染等引起的負(fù)氮平衡。另外，L-纈氨酸還具有抗中樞疲勞的作用，抗外周疲勞作用，延緩運(yùn)動(dòng)性疲勞，加快運(yùn)動(dòng)后機(jī)體的修復(fù)，因此在食品和醫(yī)藥行業(yè)具有廣泛的應(yīng)用及商業(yè)價(jià)值。L-纈氨酸凝膠具有帶正電的端基，是新型低分子量凝膠，不僅可以使純化和含有無機(jī)酸和鹽的水溶液成凝膠而且可以使有機(jī)溶劑和油成膠狀，可以制備形成水凝膠，其在生物醫(yī)藥、組織工程、光化學(xué)、電化學(xué)、食品工業(yè)、化妝品等領(lǐng)域已被廣泛應(yīng)用。L-纈氨酸因其含有特殊的生理功能，市場需求量大，使得L-纈氨酸的生產(chǎn)備受關(guān)注。

目前，L-纈氨酸的生產(chǎn)方法主要有提取法、化學(xué)合成法、發(fā)酵法。提取法和化學(xué)合成法由于原料來源受限制、生產(chǎn)成本高、收率低，污染嚴(yán)重，難以實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。微生物直接發(fā)酵法生產(chǎn)L-纈氨酸具有原料來源廣泛，成本低、反應(yīng)條件溫和、容易實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)，是一種非常經(jīng)濟(jì)、高效的生產(chǎn)方法。而工業(yè)發(fā)酵中獲得高產(chǎn)的菌種，對(duì)于L-纈氨酸的發(fā)酵生產(chǎn)來說是至關(guān)重要的，是整個(gè)L-纈氨酸發(fā)酵工業(yè)的核心，是決定發(fā)酵產(chǎn)品工業(yè)價(jià)值的重要因素。隨著L-纈氨酸的市場需求不斷增加，選育高產(chǎn)、穩(wěn)定的生產(chǎn)菌種，促進(jìn)L-纈氨酸在微生物體內(nèi)的積累，進(jìn)一步提高L-纈氨酸的產(chǎn)量一直是L-纈氨酸發(fā)酵工業(yè)技術(shù)開發(fā)和發(fā)酵工程化研究的熱點(diǎn)，對(duì)促進(jìn)L-纈氨酸產(chǎn)業(yè)化的進(jìn)程具有重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是如何提高L-纈氨酸的產(chǎn)量。所要解決的技術(shù)問題不限于如所描述的技術(shù)主題，本領(lǐng)域技術(shù)人員通過以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技術(shù)主題。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明首先提供了一種制備L-纈氨酸的方法，所述方法包括利用表達(dá)蛋白質(zhì)的重組微生物生產(chǎn)L-纈氨酸；

所述蛋白質(zhì)可為下述任一種：

A1)氨基酸序列是SEQ ID No.4的蛋白質(zhì)；

A2)將SEQ ID No.4所示的氨基酸序列經(jīng)過氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的與A1)所示的蛋白質(zhì)具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白質(zhì)；

A3)在A1)或A2)的N端和/或C端連接標(biāo)簽得到的具有相同功能的融合蛋白質(zhì)。

上述方法中，所述方法可為發(fā)酵法制備L-纈氨酸，所述重組微生物可為棒桿菌屬(Corynebacterium)，具體可為谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)及其變體。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述重組微生物為谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum)CGMCC No.21260、重組菌YPV-055、YPV-056、YPV-057、YPV-058或YPV-059。

上述方法中，所述蛋白質(zhì)名稱為蛋白質(zhì)CEY17_RS13420^G239E，所述蛋白質(zhì)CEY17_RS13420^G239E也在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。