[發明專利]一種紫點海葵多肽毒素Hc-GQ及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 202111540613.0
• 申請日: 2021-12-16
• 公開（公告）號: CN114262370B
• 公開（公告）日: 2023-07-14
• 發明（設計）人: 高炳淼;廖燕玲;符金星;李明;郭琦琦
• 申請（專利權）人: 海南醫學院
• 主分類號: C07K14/435
• 分類號: C07K14/435;C07K1/08;C07K1/06;C07K1/04;A01N37/46;A01P7/04
• 代理公司: 海南漢普知識產權代理有限公司 46003
• 代理人: 劉建芳

本發明公開了一種紫點海葵多肽毒素Hc?GQ及其制備方法和應用，通過采用多肽固相合成法(SPPS)合成了線性肽Hc?GQ，對線性肽進行HPLC純化，然后利用空氣氧化法對合成的線性肽進行一步法氧化折疊，經二硫鍵定向氧化后獲得含3個二硫鍵的氧化肽Hc?GQ(二硫鍵方式C1?C6，C2?C5，C3?C4)，并對氧化折疊終產物進行HPLC純化和質譜鑒定，得到紫點海葵多肽毒素Hc?GQ，即氧化肽Hc?GQ。本發明將合成的氧化肽Hc?GQ以昆蟲注射法測試對黃粉蟲殺蟲作用，可為研發新型、高效、安全生物殺蟲劑奠定基礎。

技術領域

本發明屬于多肽相關技術領域，涉及一種紫點海葵多肽毒素Hc-GQ及其制備方法和應用。

背景技術

節肢動物害蟲分布于世界的各個角落，破壞了全球約20～30％的食物供應，而且它們也是許多人類疾病傳播的罪魁禍首。近年來，隨著化學農藥的濫用，已導致許多昆蟲物種產生抗藥性和農產品農藥殘留超標等嚴重問題，農業污染日益嚴重。為解決農業環境危機和生態安全問題，研發新型、高效、安全生物殺蟲劑迫在眉睫。如今世界許多國家從蛇毒、蝎毒、蜘蛛毒、海洋和植物等天然生物資源中篩分和鑒定各種有效生理活性成分，并利用這些天然神經生物毒素構建新型的生物殺蟲劑和抗病蟲害植物體系。

目前，捕食昆蟲的動物例如海葵、芋螺、蝎子、蜘蛛和捕食性螨等分泌的多肽類毒素，其通過昆蟲的特異性離子通道或受體而起到毒殺和捕獲獵物，但其對哺乳動物的毒性很小或無毒副作用。其中，海葵毒素由于其主要作用對象為甲殼類動物,因而在生物毒素來源的殺蟲劑開發中受到重視。因此，開展從海葵等海洋有毒生物資源中尋找殺蟲活性多肽已成為高效安全殺蟲劑研究的熱點之一。

發明內容

本研究利用高通量轉錄組學從紫點海葵(Heteractis?crispa)中發現紫點海葵多肽毒素Hc-GQ，其序列為KCQCSACGAETSLCNFTSGACLCK，具有6個半胱氨酸形成3個二硫鍵。鑒以此，本發明提出一種紫點海葵多肽毒素Hc-GQ的制備方法及其應用。

本發明的目的是提供一種紫點海葵多肽毒素Hc-GQ的制備方法及其應用，該方法制備的紫點海葵多肽毒素Hc-GQ具有高效殺蟲效果，可為研發新型、高效、安全生物殺蟲劑奠定基礎。

本發明的目的是通過以下技術方案實現的：

一種紫點海葵多肽毒素Hc-GQ，其序列為KCQCSACGAETSLCNFTSGACLCK，具有6個半胱氨酸形成3個二硫鍵，二硫鍵方式為C1-C6，C2-C5，C3-C4。

一種紫點海葵多肽毒素Hc-GQ的制備方法，包括如下步驟：

(1)稱取2-cl樹脂加入反應器中用二氯甲烷(DCM)浸泡，然后用二甲基甲酰胺(DMF)洗滌，再用DCM洗滌，加入Fmoc-Lys(tbu)-OH、DCM和N,N-二異丙基乙胺(DIEA)進行反應，后補加甲醇和DCM，封閉反應；

(2)將步驟1得到的樹脂產物抽干溶劑，用DMF洗滌，加入含哌啶的DMF溶液脫除Fmoc，抽干后用DMF洗滌，取樹脂加入檢測管中，采用茚三酮乙醇溶液和吡啶檢測，顯色即可；

(3)稱取下一個氨基酸Fmoc-Cys-OH和1-羥基苯并三唑(HOBT)加入反應器中，倒入DMF，再加入N,N'-二異丙基碳二亞胺(DIC)反應；

(4)將步驟3得到的樹脂產物抽干溶劑，用DMF洗滌，加入含哌啶的DMF溶液脫除Fmoc，抽干后用DMF洗滌，取樹脂加入檢測管中，采用茚三酮乙醇溶液和吡啶檢測，顯色即可；

(5)按照紫點海葵多肽毒素Hc-GQ的序列稱取不同氨基酸重復步驟(3)和(4)，直到肽鏈結束，檢測無色即可，此時縮合已經完全，無游離氨基存在；

(6)用甲醇沖洗步驟5得到的樹脂，抽干，倒入離心管中，加切割液切割，過濾掉樹脂，濾液中加入冰乙醚析出產物，離心去掉上層乙醚，得到粗品多肽，即線性肽Hc-GQ；