[發(fā)明專利]miRNA-140的應(yīng)用及調(diào)控斑馬魚顱面骨骼和鱗片發(fā)育的方法

在審

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• 申請日: 2021-12-15
• 公開（公告）號: CN115851828A
• 公開（公告）日: 2023-03-28
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 許強華;陳良標(biāo);張智聰;季馮鈺
• 申請（專利權(quán)）人: 上海海洋大學(xué)
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/113;C12N15/55;C12N15/11;C12Q1/6888;A01K67/027
• 代理公司: 上海唯智贏專利代理事務(wù)所(普通合伙) 31293
• 代理人: 吳瑾瑜

本發(fā)明涉及生命科學(xué)和生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種基于miR?140基因敲除斑馬魚模型構(gòu)建方法使其顱面和鱗片發(fā)育異常。通過設(shè)計miR?140基因的上下游靶點，利用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除基因，從而構(gòu)建miR?140基因敲除斑馬魚模型。與AB品系野生斑馬魚相比，miR?140^?/?的斑馬魚的頭后部鱗片形狀發(fā)生改變、鱗片變大、顱面骨發(fā)育異常，嘴變尖，說明斑馬魚miR?140調(diào)控其鱗片和顱面骨的發(fā)育；可進一步研究miR?140基因作用，對于有鱗魚與無鱗魚的進化研究也具有重大意義。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生命科學(xué)和生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種基于miR-140基因敲除斑馬魚模型構(gòu)建方法使其顱面和鱗片發(fā)育異常。

背景技術(shù)

microRNA是內(nèi)源性的非編碼RNA，現(xiàn)已知其控制著生物體內(nèi)近30％的基因表達，其通過與靶基因的mRNA的3’端非編碼區(qū)(3’UTR)互補配對，激活靶基因mRNA的降解或阻止其翻譯為蛋白質(zhì)而進行基因的調(diào)控，是生物體內(nèi)非常重要的一類非編碼RNA。近些年，CRISPR技術(shù)的興起以及作為強大而便捷的基因修飾編輯技術(shù)被廣大研究者所追捧，并迅速廣泛地應(yīng)用于人類細(xì)胞、果蠅、小鼠、斑馬魚等多種生物進行基因功能的探索以及腫瘤的發(fā)生研究等。miR-140在軟骨細(xì)胞中特異高表達，miR-140最早在斑馬魚中被識別，隨后發(fā)現(xiàn)其在人和鼠軟骨中同樣特異性表達。該基因存在于人和鼠的第16號染色體的短臂上，近年來研究發(fā)現(xiàn)，它參與軟骨細(xì)胞的分化且與骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病有關(guān)系。Miyaki等研究發(fā)現(xiàn)，miR-140^-/-小鼠表現(xiàn)出輕微的骨骼表型，包括身材矮小和體重偏輕以及顱面畸形，鼻子短小和圓頂?shù)娘B骨。魚類鱗片作為魚類的外骨骼，和牙齒、骨骼同源，均是真皮骨架的衍生物，其具有保護魚類防止外界微生物侵害，降低魚類游動時水體帶來的摩擦損傷，以及維持魚類特殊體型等重要生物學(xué)作用。目前對于斑馬魚鱗片的研究主要集中在形成模式和形態(tài)發(fā)生研究上，在分子水平上主要是基因敲除EDA、EDAR、FGFRs等與魚類鱗片相關(guān)基因進行研究，但是對參與鱗片發(fā)育的miRNA并未有相關(guān)文獻報道，其研究也對揭示有鱗魚與無鱗魚進化上有重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明旨在提供miR-140基因的應(yīng)用。

本發(fā)明提供了敲除斑馬魚miR-140的方法。

本發(fā)明的目的還在于以斑馬魚為模型，通過CRISPR/Cas9技術(shù)敲除miR-140，從而模擬其在魚體內(nèi)對顱面骨和鱗片發(fā)育過程的影響。

本發(fā)明還提供了一種調(diào)控斑馬魚顱面骨發(fā)育或鱗片發(fā)育的方法。

本發(fā)明技術(shù)方案為，miRNA-140在調(diào)控斑馬魚顱面骨發(fā)育或鱗片發(fā)育方面的應(yīng)用。

通過敲除miRNA基因，構(gòu)建miR-140基因敲除斑馬魚模型，隨后利用鈣黃綠素染色和micro-ct等方法觀察和驗證其功能，通過反復(fù)對比和觀察，發(fā)現(xiàn)miR-140^-/-的斑馬魚和AB品系野生斑馬魚相比，其頭后部鱗片形狀發(fā)生改變、鱗片變大、顱面骨發(fā)育異常，嘴變尖，說明斑馬魚miR-140能夠調(diào)控其鱗片和顱面骨的發(fā)育。

一種調(diào)控斑馬魚顱面骨發(fā)育或鱗片發(fā)育的方法，具體為，敲除斑馬魚的miRNA-140基因或者增強miRNA-140基因的表達。

敲除斑馬魚的miRNA-140基因后，斑馬魚頭后部鱗片形狀發(fā)生改變、鱗片變大、顱面骨發(fā)育異常，嘴變尖。增強斑馬魚miRNA-140基因的表達，一種構(gòu)建顱面和鱗片發(fā)育異常的斑馬魚模型的方法，具體為，敲除斑馬魚的miRNA-140基因。具體步驟包括：

(1)敲除斑馬魚的一細(xì)胞期受精卵中的miRNA-140基因，獲得miR-140基因敲除的斑馬魚雜合子F0代；

(2)將F0代與AB型野生斑馬魚雜交獲得F1代，經(jīng)基因測序，獲得miR-140基因缺失的雜合子；