[發明專利]一種新冠病毒感染致死性小鼠動物模型及其構建方法

在審

• 申請號: 202111524123.1
• 申請日: 2021-12-14
• 公開（公告）號: CN114350706A
• 公開（公告）日: 2022-04-15
• 發明（設計）人: 王妍;鄭敏;劉剛;米繼東;戰大偉
• 申請（專利權）人: 斯貝福（北京）生物技術有限公司;北京希諾谷生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/57;C12N15/66;C12N15/89;A01K67/027
• 代理公司: 北京同輝知識產權代理事務所(普通合伙) 11357
• 代理人: 楊敬

本發明公開了一種新冠病毒感染致死性小鼠動物模型及其構建方法，構建方法包括如下步驟：以化學合成的人ACE2基因CDS區序列為模板，進行hACE2基因序列擴增；使用限制性內切酶對pCAG?EGFP?N1質粒和hACE2擴增產物進行酶切，膠回收目的DNA片段；pCAG?EGFP?N1的DNA片段和hACE2的DNA片段酶連接，得到pCAG?hACE2?N1質粒載體，再次酶切和膠回收，得到線性化的注射DNA片段；將注射DNA片段注射到小鼠受精卵的細胞核內，將注射后的小鼠受精卵移植到假孕小鼠的體內，得到首建鼠，進行傳代，感染并篩選出新冠病毒感染致死的小鼠，得到新冠病毒感染致死性小鼠動物模型。

技術領域

本發明屬于在基因工程的領域，具體涉及一種新冠病毒感染致死性小鼠動物模型及其構建方法。

背景技術

COVID-19的病原體為嚴重急性呼吸系統綜合癥相關冠狀病毒(SARSr-CoV)，命名為SARS-CoV-2。盡管為控制該疾病做出了相當大的努力，但該病毒仍在許多國家繼續流行，具有不同程度的臨床表現。SARS-CoV-2入院患者表現出肺炎癥狀，胸部CT掃描結果異常；其感染的臨床癥狀從無癥狀到有癥狀不等，包括呼吸道癥狀、發燒、呼吸急促、咳嗽、呼吸困難和病毒性肺炎，在嚴重的情況下，肺炎、嚴重急性呼吸系統綜合癥、心力衰竭、腎功能衰竭，甚至死亡。與COVID-19相關的主要死亡原因是呼吸衰竭，其次是感染性休克、腎衰竭、出血和心力衰竭。

冠狀病毒是有包膜的、基因組為線性單股正鏈的RNA病毒，屬于Nidovirales目中的冠狀病毒科。該病毒有四個屬，即alpha(α)、beta(β)、gamma (γ)和delta(δ)。然而，新型SARS-CoV-2屬于β-冠狀病毒屬，其RNA基因組大小為29.9kb。SARS-CoV-2是繼SARS-CoV和MERS-CoV之后的第3 種高致病性冠狀病毒。據報道，SARS-CoV-2與SARS-CoV的序列相似性為79％，與MERS-CoV的相似性為50％。越來越多的研究表明，SARS-CoV-2 和SARS-CoV和MERS-CoV一樣，是通過血管緊張素轉換酶2(ACE2)進入細胞，并感染機體，但具體發病機制尚不完全明確。此外是，盡管SARS-CoV-2 和SARS-CoV之間具有受體結合域(RBD)結構同源性，但一些已發表的 SARS-CoV RBD單克隆抗體仍無法中和SARS-CoV-2。因此我們需要更多的動物感染模型來了解病毒發病機制、疫苗開發和藥物篩選。

然而，之前的研究表明，SARS-CoV-2可以使用人類、蝙蝠或果子貍 ACE2作為細胞受體，但不能使用小鼠ACE2作為受體。非人類靈長類動物也有助于臨床前評估，但非人靈長類、蝙蝠和果子貍受到實驗室動物應用范圍、成本、飼養等條件的限制，無法廣泛應用于實驗研究，而作為最常使用的實驗動物，SARS-CoV-2在小鼠中復制能力很差，基本上不感染。

有鑒于此，特提出本發明。

發明內容

本發明的目的是提供一種新冠病毒感染致死性小鼠動物模型及其構建方法，構建表達hACE2蛋白的小鼠，為SARS-CoV-2發病機制、疫苗開發和藥物篩選提供新型實驗動物模型。

為了實現上述目的，本發明提供的一種新冠病毒感染致死性小鼠動物模型的構建方法，包括如下步驟：

(1)以化學合成的人ACE2基因CDS區序列為模板，進行hACE2基因序列擴增，得到hACE2擴增產物；

(2)使用EcoRI限制性內切酶and NotI限制性內切酶對pCAG-EGFP-N1 質粒進行酶切；

(3)使用EcoRI限制性內切酶and NotI限制性內切酶對步驟(1)得到的hACE2擴增產物進行酶切；

(4)膠回收步驟(2)酶切的pCAG-EGFP-N1質粒載體，得到pCAG-EGFP-N1的DNA片段，膠回收步驟(3)酶切的hACE2擴增產物，得到hACE2的DNA片段；