[發明專利]一種新冠病毒感染致死性小鼠動物模型及其構建方法

在審

• 申請號: 202111524123.1
• 申請日: 2021-12-14
• 公開（公告）號: CN114350706A
• 公開（公告）日: 2022-04-15
• 發明（設計）人: 王妍;鄭敏;劉剛;米繼東;戰大偉
• 申請（專利權）人: 斯貝福（北京）生物技術有限公司;北京希諾谷生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/57;C12N15/66;C12N15/89;A01K67/027
• 代理公司: 北京同輝知識產權代理事務所(普通合伙) 11357
• 代理人: 楊敬

1.一種新冠病毒感染致死性小鼠動物模型的構建方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)以化學合成的人ACE2基因CDS區序列為模板，進行hACE2基因序列擴增，得到hACE2擴增產物；

(2)使用EcoRI限制性內切酶和NotI限制性內切酶對pCAG-EGFP-N1質粒進行酶切；

(3)使用EcoRI限制性內切酶和NotI限制性內切酶對步驟(1)得到的hACE2擴增產物進行酶切；

(4)膠回收步驟(2)酶切的pCAG-EGFP-N1質粒載體，得到pCAG-EGFP-N1的DNA片段，膠回收步驟(3)酶切的hACE2擴增產物，得到hACE2的DNA片段；

(5)使用連接酶將步驟(4)得到的pCAG-EGFP-N1的DNA片段和hACE2的DNA片段酶連接，得到pCAG-hACE2-N1質粒載體；

(6)使用SpeI限制性內切酶和AflII限制性內切酶對步驟(5)得到的pCAG-hACE2-N1質粒載體進行酶切；

(7)膠回收步驟(6)酶切的pCAG-hACE2-N1質粒載體，得到線性化的注射DNA片段。

(8)取小鼠受精卵，將步驟(7)得到的注射DNA片段注射到小鼠受精卵的細胞核內，將注射后的小鼠受精卵移植到假孕小鼠的體內，得到首建鼠，首建鼠進行傳代；

(9)步驟(8)得到的首建鼠傳代繁育的小鼠感染新冠病毒，篩選出新冠病毒感染致死的小鼠，得到新冠病毒感染致死性小鼠動物模型。

2.根據權利要求1所述的新冠病毒感染致死性小鼠動物模型的構建方法，其特征在于，步驟(1)的擴增體系中包括基因正向引物序列、基因反向引物序列和PCR反應體系，其中

基因正向引物序列hACE2-F：SEQ ID NO.1，

基因反向引物序列hACE2-R：SEQ ID NO.2。

3.根據權利要求1所述的新冠病毒感染致死性小鼠動物模型的構建方法，其特征在于，步驟(1)中得到的所述hACE2擴增產物的序列為SEQ ID NO.3。

4.根據權利要求1所述的新冠病毒感染致死性小鼠動物模型的構建方法，其特征在于，步驟(5)得到pCAG-hACE2-N1質粒載體的序列為SEQ ID NO.4。

5.根據權利要求1所述的新冠病毒感染致死性小鼠動物模型的構建方法，其特征在于，步驟(5)中所述pCAG-EGFP-N1的DNA片段和所述hACE2的DNA片段通過T4 DNA連接酶進行酶連接。

6.根據權利要求1所述的新冠病毒感染致死性小鼠動物模型的構建方法，其特征在于，步驟(8)得到的首建鼠和步驟(9)中傳代繁育的小鼠在感染新冠病毒前進行基因型鑒定。

7.根據權利要求6所述的新冠病毒感染致死性小鼠動物模型的構建方法，其特征在于，所述首建鼠和所述傳代繁育的小鼠通過PCR方法進行基因型鑒定，其中正向鑒定引物序列為SEQ ID NO.5，反向鑒定引物序列為SEQ ID NO.6。

8.根據權利要求1所述的新冠病毒感染致死性小鼠動物模型的構建方法，其特征在于，步驟(8)中所述注射DNA片段以100ng/uL的濃度注射到小鼠受精卵的細胞核內。

9.根據權利要求1所述的新冠病毒感染致死性小鼠動物模型的構建方法，其特征在于，步驟(8)中小鼠受精卵的獲取，包括以下步驟：取4-5周齡的雌性小鼠，注射孕馬血清促性腺激素10IU，間隔46-48小時后，注射人絨毛膜促性腺激素10IU，注射激素后的雌性小鼠與10周齡以上雄性小鼠合籠10-12小時，檢栓，取受精卵。

10.一種新冠病毒感染致死性小鼠動物模型，其特征在于，根據權利要求1-9任一項所述的新冠病毒感染致死性小鼠動物模型的構建方法構建。