[發明專利]一種用于檢測SARS-CoV-2 69:70del位點的方法

有效

• 申請號: 202111518202.1
• 申請日: 2021-12-14
• 公開（公告）號: CN113913406B
• 公開（公告）日: 2022-04-08
• 發明（設計）人: 孫巖松;李浩;韓堯;牛夢偉;董雪
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍軍事科學院軍事醫學研究院
• 主分類號: C12N9/22
• 分類號: C12N9/22;C12N15/113;C12Q1/70;C12Q1/686
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 閆書寧

本發明公開了一種用于檢測SARS?CoV?2 69:70del位點的CRISPR?Cas13a系統及其使用的crRNA。該系統包括Cas13a蛋白和crRNA；SARS?CoV?2 69:70del位點的靶點序列位于SARS?CoV?2基因組第21753?21786位，并缺失tacatg 6個堿基；SARS?CoV?2 69:70del位點的crRNA序列如SEQ ID NO:3所示。實驗證明，本發明提供的crRNA可通過激活Cas13a實現對SARS?CoV?2 69:70del位點核酸的高靈敏、高特異檢測，靈敏度達到單拷貝（1copy/test）。本發明具有重要的應用價值。

技術領域

本發明屬于分子診斷技術領域，具體涉及一種用于檢測SARS-CoV-2 69:70del位點的CRISPR-Cas13a系統及其使用的crRNA。

背景技術

COVID-19是由嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（severe acute respiratorysyndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）所引起的疾病。隨著時間的推移，SARS-CoV-2出現了多種新的值得關注的變異株（VOCs）。B.1.1.7 譜系（VOC202012/01， 501Y.V1）首先出現在英格蘭南部，這個譜系的特征在于17個突變，包括14個氨基酸替換和3個位于ORF 1 a/b，ORF8，Spike（S）和N基因區域2的框架內缺失。而位于S基因區中的69:70del已被證明具有潛在的生物學意義。69:70del是SARS-CoV-2刺突蛋白（Spike protein，S蛋白）n端結構域（ntd）中的第69位的組氨酸（h69）和第70位的纈氨酸（v70）缺失突變，69:70del 可引起 S蛋白 S1亞基構象改變。目前已有研究表明，69:70del主要與造成免疫逃逸的突變位點同時出現，增強病毒的細胞感染力。此外，基于目前的監測數據69:70del 還常與位于S蛋白的N501Y、N439K 以及 Y453F 突變同時出現。已有研究證明，利用假病毒模擬B.1.1.7變異株S 蛋白的氨基酸突變，69:70del的B.1.1.7病毒變異株對細胞的感染力顯著增強。研究顯示，69:70del增強病毒感染力的機制可能是通過增加病毒粒子表面 S 蛋白密度來實現的。目前，對SARS-CoV-2變異株的檢測方法主要有兩種。第一種方法，即目前主要采用的方法，是基因測序方法，主要包括一代測序和下一代測序。盡管這種技術對于識別新變異很重要，并且能夠實時跟蹤VOC，但它非常耗時，并且需要大量的數據分析，且無法在所有實驗室中進行。其他檢測方法主要是基于RT-qPCR進行檢測，盡管比基因測序方法更快，但其樣本處理復雜，且對儀器精度要求高。

2017年4月，美國研究人員建立了一種靈敏度達到埃摩級（單拷貝）、特異性達到單堿基的核酸檢測技術—基于CRISPR-Cas13a的核酸檢測平臺SHERLOCK（Specific HighSensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKing），利用Leptotrichia wadei Cas13a蛋白（LwCas13a）的非特異剪切活性，結合可以高效擴增目的片段的重組聚合酶擴增技術（Recombinase Polymerase Amplification，RPA），實現了對痕量核酸快速、廉價、高靈敏的檢測。研究表明，Cas13a可用于生物樣本（血液或尿液）中寨卡以及登革熱病毒的鑒定，并進一步區分非洲毒株和美洲毒株的基因序列，還可用于鑒定細菌的特定類型。而其在鑒定病毒或細菌核酸之后，通過設計特異的crRNA可以直接用于病原體的分型，其超高的靈敏度避免了大量復雜的上游實驗工作，即可直接擴增生物樣本進行檢測，縮短了樣品的前處理過程。由此可見，該技術在基礎研究、診斷和治療領域的巨大應用前景。

發明內容

本發明的目的在于將PCR技術與基于Cas13a蛋白的CRISPR結合，通過設計、構建、篩選，最終提供一段能靶向SARS-CoV-2 69:70del位點，并激活CRISPR-Cas13a系統的crRNA，利用該靶點構建的CRISPR-Cas13a系統能夠特異性地檢測SARS-CoV-2 69:70del位點。