[發(fā)明專利]一種用于檢測(cè)SARS-CoV-2 69:70del位點(diǎn)的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202111518202.1
• 申請(qǐng)日: 2021-12-14
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN113913406B
• 公開(kāi)（公告）日: 2022-04-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 孫巖松;李浩;韓堯;牛夢(mèng)偉;董雪
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)人民解放軍軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院
• 主分類號(hào): C12N9/22
• 分類號(hào): C12N9/22;C12N15/113;C12Q1/70;C12Q1/686
• 代理公司: 北京紀(jì)凱知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11245
• 代理人: 閆書(shū)寧

1.一種用于檢測(cè)SARS-CoV-2 69:70del位點(diǎn)的CRISPR-Cas13a系統(tǒng)，為a1）或a2）：

a1）Cas13a蛋白和crRNA；

a2）Cas13a蛋白和所述crRNA形成的復(fù)合體；

所述crRNA包括用于與Cas13a蛋白結(jié)合的錨定序列和靶向SARS-CoV-2 69:70del位點(diǎn)靶點(diǎn)序列的向?qū)蛄校?/p>

所述SARS-CoV-2 69:70位點(diǎn)野生型的靶點(diǎn)序列位于SARS-CoV-2基因組第21753-21780位；所述SARS-CoV-2 69:70del位點(diǎn)的靶點(diǎn)序列位于SARS-CoV-2基因組第21753-21786位，并缺失tacatg 6個(gè)堿基；

所述SARS-CoV-2 69:70del位點(diǎn)的靶點(diǎn)序列如SEQ ID NO:1所示；所述SARS-CoV-2 69:70位點(diǎn)野生型的靶點(diǎn)序列如SEQ ID NO:2所示；

所述SARS-CoV-2 69:70del位點(diǎn)的crRNA序列如SEQ ID NO:3所示；所述SARS-CoV-269:70位點(diǎn)野生型的crRNA序列如SEQ ID NO:4所示。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的CRISPR-Cas13a系統(tǒng)，其特征在于：所述Cas13a蛋白為L(zhǎng)wCas13a蛋白。

3.一種用于檢測(cè)SARS-CoV-2 69:70del位點(diǎn)的試劑盒，其包括權(quán)利要求1或2所述的用于檢測(cè)SARS-CoV-2 69:70del位點(diǎn)的CRISPR-Cas13a系統(tǒng)。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于：所述試劑盒還包括用于特異性擴(kuò)增SARS-CoV-2 69:70del位點(diǎn)的靶點(diǎn)序列的引物對(duì)；所述引物對(duì)由SEQ ID NO:7所示的單鏈DNA分子和SEQ ID NO:8所示的單鏈DNA分子組成。

5.如下任一應(yīng)用：

B1）權(quán)利要求1或2所述的系統(tǒng)或權(quán)利要求3或4所述的試劑盒在制備檢測(cè)或輔助檢測(cè)SARS-CoV-2 69:70del位點(diǎn)的產(chǎn)品中的應(yīng)用；

B2）權(quán)利要求1或2所述的系統(tǒng)或權(quán)利要求3或4所述的試劑盒在制備檢測(cè)或輔助檢測(cè)待測(cè)樣本中是否含有SARS-CoV-2 69:70del位點(diǎn)的產(chǎn)品中的應(yīng)用；

B3）權(quán)利要求1或2所述的系統(tǒng)或權(quán)利要求3或4所述的試劑盒在篩選或輔助篩選SARS-CoV-2 69:70del位點(diǎn)防治藥物中的應(yīng)用；

B4）權(quán)利要求1或2所述的系統(tǒng)或權(quán)利要求3或4所述的試劑盒在制備篩選或輔助篩選SARS-CoV-2 69:70del位點(diǎn)防治藥物的產(chǎn)品中的應(yīng)用。

6.一種檢測(cè)或輔助檢測(cè)SARS-CoV-2 69:70del位點(diǎn)的方法，包括如下步驟：

C1）以待測(cè)樣本的核酸為模板，采用由SEQ ID NO:7所示的單鏈DNA分子和SEQ ID NO:8所示的單鏈DNA分子組成的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR產(chǎn)物；

C2）配制CRISPR-Cas13a檢測(cè)體系，之后進(jìn)行熒光檢測(cè)；所述CRISPR-Cas13a檢測(cè)體系包括所述PCR產(chǎn)物、權(quán)利要求1或2中所述的Cas13a蛋白、權(quán)利要求1中所述的crRNA、NTP、T7RNA聚合酶；同時(shí)以水替代所述PCR產(chǎn)物作為陰性對(duì)照；

C3）檢測(cè)所述CRISPR-Cas13a檢測(cè)體系的熒光強(qiáng)度，根據(jù)熒光強(qiáng)度的大小判定所述待測(cè)樣本中是否含有SARS-CoV-2 69:70del位點(diǎn)：若在同一檢測(cè)時(shí)間內(nèi)，待測(cè)樣本檢測(cè)體系的熒光強(qiáng)度值比陰性對(duì)照熒光強(qiáng)度值高3倍以上，則待測(cè)樣本含有或候選含有SARS-CoV-2 69:70del位點(diǎn)，否則待測(cè)樣本不含有或候選不含有SARS-CoV-2 69:70del位點(diǎn)；

所述方法用于非疾病的診斷與治療。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于：所述步驟C3）中，所述檢測(cè)的條件為：35-39℃，每1-3min讀取一次熒光強(qiáng)度值，讀取20次以上。