[發(fā)明專利]鴨坦布蘇病毒感染性cDNA的制備方法、重組病毒rDTMUV-QY21的制備方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202111517150.6
• 申請(qǐng)日: 2021-12-13
• 公開（公告）號(hào): CN114196683A
• 公開（公告）日: 2022-03-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳瑞愛;王婷;黃梅;向程威;楊潔;楊澤坤
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)與技術(shù)廣東省實(shí)驗(yàn)室肇慶分中心;華農(nóng)（肇慶）生物產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院有限公司
• 主分類號(hào): C12N15/40
• 分類號(hào): C12N15/40;C12N15/85;C12N7/01;C12R1/93
• 代理公司: 廣州市科豐知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 44467
• 代理人: 羅嘯秋

本發(fā)明屬于獸用制品領(lǐng)域，公開了一種鴨坦布蘇病毒感染性cDNA的制備方法，包括如下步驟：步驟1：構(gòu)建亞基因組質(zhì)粒，所述亞基因組質(zhì)粒為質(zhì)粒pF1、pF2、pF3、pF4，質(zhì)粒pF1、pF2、pF3、pF4分別含目標(biāo)片段F1、F2、F3、F4；步驟2：獲取目標(biāo)片段：從質(zhì)粒pF1、pF2、pF3、pF4上獲取用于體外連接的目標(biāo)片段f1、f2、f3、f4；步驟3：體外連接目標(biāo)片段f1、f2、f3、f4，獲得鴨坦布蘇病毒感染性cDNA。該方法可以成功的克隆出與原病毒株完全相同、無突變的重組病毒。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及獸用制品領(lǐng)域，具體為一種鴨坦布蘇病毒感染性cDNA的制備方法、重組 病毒rDTMUV-QY21的制備方法。

背景技術(shù)

2010年4月，中國(guó)各地的許多養(yǎng)鴨場(chǎng)爆發(fā)了一種新的疾病。該病特征癥狀包括食欲下 降、產(chǎn)蛋下降、卵巢的充血、出血、變性、退化以及淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，嚴(yán)重病例可致死亡。 經(jīng)病毒的分離與鑒定，確定引起該病的病原為一種新的黃病毒，命名為鴨坦布蘇病毒(DuckTembusu Virus，DTMUV)。近能年來，以生長(zhǎng)遲緩和產(chǎn)蛋量下降為特征的鴨坦布蘇病毒病 已在中國(guó)的養(yǎng)鴨區(qū)域出現(xiàn)大面積傳播，并對(duì)中國(guó)的水禽養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。然而，目前市面上針對(duì)該病毒的疫苗仍以傳統(tǒng)滅活疫苗為主。該疫苗的保護(hù)效價(jià)并不十分理想以至于需要重復(fù)接種，因此給養(yǎng)鴨行業(yè)造成較重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。

通過建立DTMUV重組平臺(tái)將為進(jìn)一步快速創(chuàng)制應(yīng)對(duì)各種流行毒株的新型疫苗打下堅(jiān) 實(shí)基礎(chǔ)，并為深入研究該病毒與宿主的相互作用，免疫和致病機(jī)制提供切實(shí)有用的工具。

DTMUV屬于黃病毒屬，黃病毒科。其基因組只有一個(gè)長(zhǎng)的獨(dú)立開放閱讀框，編碼3個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白：核衣殼(C)、膜(M)和包膜(E)；以及7個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白：NS1、NS2A、 NS2B、NS3、NS4A、NS4BNS5。

本申請(qǐng)所要解決的技術(shù)問題是：如何快速建立鴨坦布蘇病毒QY21株感染性cDNA，為進(jìn)一步開發(fā)針對(duì)鴨坦布蘇病毒的新型疫苗提供平臺(tái)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種鴨坦布蘇病毒感染性cDNA的制備方法以及重組病毒rDTMUV-QY21的制備方法，該方法可以成功的克隆出與原病毒株完全相同、無突變的重 組病毒。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：一種鴨坦布蘇病毒感染性cDNA的制備 方法，包括如下步驟：

步驟1：構(gòu)建亞基因組質(zhì)粒，所述亞基因組質(zhì)粒為質(zhì)粒pF1、pF2、pF3、pF4，質(zhì)粒pF1、pF2、pF3、pF4分別含目標(biāo)片段F1、F2、F3、F4；

步驟2：獲取目標(biāo)片段：從質(zhì)粒pF1、pF2、pF3、pF4上獲取用于體外連接的目標(biāo)片段f1、f2、f3、f4；

步驟3：體外連接目標(biāo)片段f1、f2、f3、f4，獲得鴨坦布蘇病毒感染性cDNA；

目標(biāo)片段F1/f1的序列在序列表SEQ ID NO：1中位置為1-3490；

目標(biāo)片段F2/f2的序列在序列表SEQ ID NO：1中位置為3471-6599；

目標(biāo)片段F3/f3的序列在序列表SEQ ID NO：1中位置為6580-10599；

目標(biāo)片段F4的序列在序列表SEQ ID NO：1中位置為8162-10990；

目標(biāo)片段f4的序列在序列表SEQ ID NO：1中位置為10580-10990。

在上述的鴨坦布蘇病毒感染性cDNA的制備方法中，所述步驟1具體為：

步驟11：利用引物Vector-F、Vector-R以pBR322-Base為模板，通過PCR擴(kuò)增pBR322載體，然后經(jīng)膠回收備用，得到的pBR322-Base-T7pro；