[發明專利]鴨坦布蘇病毒感染性cDNA的制備方法、重組病毒rDTMUV-QY21的制備方法

在審

• 申請號: 202111517150.6
• 申請日: 2021-12-13
• 公開（公告）號: CN114196683A
• 公開（公告）日: 2022-03-18
• 發明（設計）人: 陳瑞愛;王婷;黃梅;向程威;楊潔;楊澤坤
• 申請（專利權）人: 嶺南現代農業科學與技術廣東省實驗室肇慶分中心;華農（肇慶）生物產業技術研究院有限公司
• 主分類號: C12N15/40
• 分類號: C12N15/40;C12N15/85;C12N7/01;C12R1/93
• 代理公司: 廣州市科豐知識產權代理事務所(普通合伙) 44467
• 代理人: 羅嘯秋

1.一種鴨坦布蘇病毒感染性cDNA的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：

步驟1：構建亞基因組質粒，所述亞基因組質粒為質粒pF1、pF2、pF3、pF4，質粒pF1、pF2、pF3、pF4分別含目標片段F1、F2、F3、F4；

步驟2：獲取目標片段：從質粒pF1、pF2、pF3、pF4上獲取用于連接全長的目標片段f1、f2、f3、f4；

步驟3：體外連接目標片段f1、f2、f3、f4，獲得鴨坦布蘇病毒感染性全長cDNA；

目標片段F1/f1的序列在序列表SEQ ID NO：1中位置為1-3490；

目標片段F2/f2的序列在序列表SEQ ID NO：1中位置為3471-6599；

目標片段F3/f3的序列在序列表SEQ ID NO：1中位置為6580-10599；

目標片段F4的序列在序列表SEQ ID NO：1中位置為8162-10990；

目標片段f4的序列在序列表SEQ ID NO：1中位置為10580-10990。

2.根據權利要求1所述的鴨坦布蘇病毒感染性全長cDNA的制備方法，其特征在于，所述步驟1具體為：

步驟11：利用引物Vector-F、Vector-R以pBR322-Base為模板，通過PCR擴增pBR322載體，然后經膠回收備用，得到的pBR322-Base-T7pro；

步驟12：分別用帶同源臂的引物、以DTMUV-QY21全基因組為模板通過RT-PCR技術擴增帶同源臂的cDNA片段，得到目標片段F1、F2、F3、F4；

步驟13：將目標片段F1、F2、F3、F4分別和pBR322-Base-T7pro進行同源重組，得到質粒pF1、pF2、pF3、pF4；

步驟12中，擴增目標片段F1所用引物為F1-F、F1-R；

擴增目標片段F2所用引物為F2-F、F2-R；

擴增目標片段F3所用引物為F3-F、F3-R；

擴增目標片段F4所用引物為F4-F、F4-R；

Vector-F、Vector-R、F2-F、F2-R、F3-F、F3-R、F4-F、F4-R的序列如序列表SEQ ID NO：2～SEQ ID NO：9所示；

鴨坦布蘇病毒的全長序列如序列表SEQ ID NO：1所示。

3.一種鴨坦布蘇重組病毒rDTMUV-QY21的制備方法，其特征在于，采用如權利要求1或2所述的鴨坦布蘇病毒感染性cDNA進行體外轉錄，獲得鴨坦布蘇重組病毒rDTMUV-QY21。