[發明專利]缺失丙二酸半醛旁路代謝路徑脫氮假單胞菌的構建方法

在審

• 申請號: 202111513324.1
• 申請日: 2021-12-12
• 公開（公告）號: CN114317388A
• 公開（公告）日: 2022-04-12
• 發明（設計）人: 周生芳;李紅雨;章穎莉
• 申請（專利權）人: 江蘇師范大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/78;C12N15/53;C12N15/54;C12P7/42;C12R1/38
• 代理公司: 徐州先卓知識產權代理事務所(普通合伙) 32555
• 代理人: 陳俊杰

1.缺失丙二酸半醛旁路代謝路徑脫氮假單胞菌的構建方法，其特征在于，包括：

(1)從已構建的脫氮假單胞菌ZAP01出發，在該菌株基因組DNA中分別單獨和組合敲除mmsAI，mmsAII、mmsAIII和BAPAT基因，獲得若干突變菌株；

(2)通過構建質粒pUCPK-AM，過表達3-HP合成路徑相關酶轉化乙酸生產3-HP；

(3)在含有30mg/L的卡那霉素LB平板上篩選獲得目標突變重組菌。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(1)包括：

從已構建的脫氮假單胞菌ZAP01出發，在該菌株基因組DNA中分別單獨和組合敲除mmsAI，mmsAII、mmsAIII和BAPAT基因，獲得突變菌株ZAP01ΔmmsAI、ZAP01ΔmmsAII、ZAP01ΔmmsAIII、ZAP01ΔBAPAT、ZAP01ΔmmsAIΔmmsAIIΔmmsAIII和ZAP01ΔmmsAIΔmmsAIIΔmmsAIIIΔBAPAT。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)包括：

構建質粒pUCPK-AM，利用電穿孔儀將pUCPK-AM質粒通過電轉化分別轉入到突變菌株ZAP01ΔmmsAI、ZAP01ΔmmsAII、ZAP01ΔmmsAIII、ZAP01ΔBAPAT、ZAP01ΔmmsAI、ZAP01ΔmmsAIΔmmsAIIΔmmsAIII和ZAP01ΔmmsAIΔmmsAIIΔmmsAIIIΔBAPAT中。

4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，所述電轉化所用電極條件為25μF，200Ω，180V，電擊杯寬度為2mm。

5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)包括：

將突變重組菌分別在LB平板上過夜培養；

從該新鮮平板上單菌落接種到含有10mL種子培養基的50mL三角瓶中，37℃、250rpm培養12小時，所得種子液OD600值為3-4；

然后分別以接種后OD600＝0.1的接種量將各菌株種子液接種到50mL發酵培養基中，發酵采用250mL三角瓶，控制溫度37℃、250rpm，補料發酵，在9h、24h，31h和35h分別補料3g/L、4g/L、4g/L和4g/L的乙酸鈉，發酵時間48小時；

對比3-HP的產量和產率，選出最優目標菌株。

6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，所述種子培養基的配方為：10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母膏，10g/L氯化鈉。

7.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，所述發酵培養基的配方是：100mmol/L磷酸緩沖液(pH7.0)、8g/L乙酸鈉、0.25g/L硫酸鎂、1g/L氯化銨、1g/L酵母膏。