[發明專利]缺失丙二酸半醛旁路代謝路徑脫氮假單胞菌的構建方法

在審

• 申請號: 202111513324.1
• 申請日: 2021-12-12
• 公開（公告）號: CN114317388A
• 公開（公告）日: 2022-04-12
• 發明（設計）人: 周生芳;李紅雨;章穎莉
• 申請（專利權）人: 江蘇師范大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/78;C12N15/53;C12N15/54;C12P7/42;C12R1/38
• 代理公司: 徐州先卓知識產權代理事務所(普通合伙) 32555
• 代理人: 陳俊杰

缺失丙二酸半醛旁路代謝路徑脫氮假單胞菌的構建方法，包括：(1)從已構建的脫氮假單胞菌ZAP01出發，在該菌株基因組DNA中分別單獨和組合敲除mmsAI，mmsAII、mmsAIII和BAPAT基因，獲得若干突變菌株；(2)通過構建質粒pUCPK?AM，過表達3?HP合成路徑相關酶轉化乙酸生產3?HP；(3)在含有30mg/L的卡那霉素LB平板上篩選獲得目標突變重組菌。本發明的方法通過在脫氮假單胞菌中敲除丙二酸半醛脫氫酶和β?丙氨酸?丙酮酸轉氨酶，完全阻斷丙二酸半醛支路代謝路徑，使更多的丙二酸半醛用于3?HP的合成，從而提高乙酸合成3?HP的產量。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體涉及一株缺失丙二酸半醛旁路代謝路徑脫氮假單胞菌的構建方法。

背景技術

丙二酰輔酶A合成3-羥基丙酸(3-HP)的代謝路徑是目前具有較高前景的生物合成3-HP的主要路線。胞內丙二酰輔酶A由乙酰輔酶A羧化酶(ACC)羧化乙酰輔酸半醛脫氫酶(MCRN))的作用下合成3-HP。實驗室前期在脫氮假單胞菌ZAP中通過過表達ACC、MCRC和MCRN構建了一株經由丙二酰輔酶A路徑代謝乙酸生物合成3-HP的重組菌株。但是，該菌轉化乙酸合成3-HP的得率低下。乙酸活化生成中間代謝物乙酰輔酶A后，依次生成中間產物丙二酰輔酶A和丙二酸半醛。中間產物乙酰輔酶A和丙二酰輔酶A還分別是進入中心代謝TCA循環和脂肪酸合成的必酶A而形成，丙二酰輔酶A經過丙二酸單酰輔酶A還原酶(MCRC)生成丙二酸半醛，丙二酸半醛在丙二要物質，不能完全阻斷而只能通過下調TCA循環和脂肪酸合成的活性來增大乙酸合成3-HP的代謝通量；而中間產物丙二酸半醛是β-丙氨酸代謝的產物，β-丙氨酸作為碳源時，假單胞菌可以通過轉氨基酶將其轉化為丙二酸半醛；然后丙二酸半醛被NAD+依賴的丙二酸半醛脫氫酶氧化為乙酰輔酶A。完全阻斷丙二酸半醛脫氫酶可以提高乙酸合成3-HP的代謝通量。假單胞菌中NAD+-依賴的丙二酸半醛脫氫酶催化丙二酸半醛可轉化為兩種不同的產物，這取決于CoA作為共底物的可用性。在CoA存在的情況下，丙二酸半醛轉化為乙酰輔酶A和碳酸氫鹽，但在沒有CoA的情況下，丙二酸半醛會較慢的反應，最終生成乙酸鹽。另外，假單胞菌可以通過β-丙氨酸-丙酮酸轉氨酶催化底物丙二酸半醛合成β-丙氨酸。

發明內容

本發明的目的在于一種缺失丙二酸半醛旁路代謝路徑脫氮假單胞菌的構建方法，通過在脫氮假單胞菌中敲除丙二酸半醛脫氫酶(由mmsA基因編碼)和β-丙氨酸-丙酮酸轉氨酶(由BAPAT基因編碼)，完全阻斷丙二酸半醛支路代謝路徑，使更多的丙二酸半醛用于3-HP的合成，從而提高乙酸合成3-HP的產量。

為實現上述發明目的，本發明的技術方案具體如下：

缺失丙二酸半醛旁路代謝路徑脫氮假單胞菌的構建方法，包括：

(1)從已構建的脫氮假單胞菌ZAP01出發，在該菌株基因組DNA中分別單獨和組合敲除mmsAI，mmsAII、mmsAIII和BAPAT基因，獲得若干突變菌株；

(2)通過構建質粒pUCPK-AM，過表達3-HP合成路徑相關酶轉化乙酸生產3-HP；

(3)在含有30mg/L的卡那霉素LB平板上篩選獲得目標突變重組菌。

進一步的，所述步驟(1)包括：

從已構建的脫氮假單胞菌ZAP01出發，在該菌株基因組DNA中分別單獨和組合敲除mmsAI，mmsAII、mmsAIII和BAPAT基因，獲得突變菌株ZAP01ΔmmsAI、ZAP01ΔmmsAII、ZAP01ΔmmsAIII、ZAP01ΔBAPAT、ZAP01ΔmmsAIΔmmsAIIΔmmsAIII和ZAP01ΔmmsAIΔmmsAIIΔmmsAIIIΔBAPAT。

進一步的，所述步驟(2)包括：